原代细胞培养和死活细胞鉴别血球计数实验SOP.doc

原代细胞的培养与鉴定标准操作流程(SOP)
一、【实验目的】
(此处以动物小鼠为例)。
、营养液的配制等,初步掌握无菌操作方法。
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二、【实验原理】
(一) 细胞原代培养
原代细胞培养是指直接从动物或者人体内获取的细胞、组织和器官,经体外培养后,直到第一次传代为止。这种培养,首先用无菌操作的方法,从动物体内取出所需的组织(或器官),经消化,分解成单个游离细胞,在人工培养下,使其不断的生长及繁殖。
细胞培养是一种操作繁琐而又要求十分严谨的实验技术。要使细胞能在体外长期生长,必须满足两个基本要求:一是供给细胞存活所必须的条件,如适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气、适宜的温度,注意外环境酸碱度与渗透压的调节。二是严格控制无菌条件。
(二) 细胞死活鉴定
在显微镜下活细胞细胞膜完整、立体感强,胞质透明度好,颗粒状物质少;死细胞膜破裂,无立体感,细胞通透性差,有颗粒状物质、空泡。
培养好的细胞培养液颜色呈土黄色,透明度好,不浑浊,发亮,有浑浊可能是污染初期或细胞太多。
染色排除法是生物研究中判断细胞活性的一种常用方法,简便,易于操作实验是利用了死活细胞在生理机能和性质上的差异来进行的。原理:因为活细胞的细胞膜具有选择透过性,细胞不需要的物质通常不能进入细胞,染色剂中如台盼蓝就不能进入细胞,因此用该染色剂处理细胞后,细胞不会被染色,由于死细胞的细胞膜是全透性的,因此台盼蓝能进入死细胞,从而可以使死细胞染色。依此染色便可以判断细胞的活性。
活细胞必需通过控制物质进出细胞膜来保持内部生理环境的稳定性。细胞死后,细胞膜通透性发生改变,原先不能进入细胞的物质也能够进入细胞。常见的细胞燃料有:中性红、台盼蓝、甲基蓝、美蓝、荧光素双醋酸酯等。台盘蓝染料正常情况下被活细胞阻拦在细胞膜外,只有细胞膜受损或者细胞死亡后,才能进入细胞,从而与解体的
DNA结合,使其着色,因此,活细胞一般不能被台盘蓝染色,而死细胞会被染成蓝色。通过显微镜很容易就能识别出死亡被染色的细胞,并可用细胞计数板进行计数。伊红和苏木精是最常用的细胞染色剂。伊红在很多生物技术中都有应用。伊红有自发荧光特性。悬液中细胞的精确计数,往往采用血细胞计数器。
荧光排除法生活力强的细胞能发出强烈的黄绿色荧光;生活力的细胞发出荧光也较弱;死亡细胞无荧光。
三、【实验器材】
解剖剪,解剖镊,棉球,培养皿,酒精灯,75%酒精,移液枪,无菌操作台,培养箱,正置光学显微镜,倒置光学显微镜,吸管,解剖盘,滴管,离心管,离心机,注射器,塑料培养皿,载玻片,盖玻片,血细胞计数板等。
四、【实验材料】
小鼠1只,细胞培养液(含生长因子),Trypen Blue染液,PBS缓冲液等
五、【实验步骤】
(一) 细胞的原代培养
1. 取材:
取小鼠一只,采用断头法处死。清水洗小鼠浸入75%酒精中消毒3min,取出转入超净工作台内的解剖盘中,无菌操作打开腹腔,取出其脾脏,除去其周围的脂肪组织,并用PBS液自上而下淋洗1-2次,转入无菌培养皿中待用。
2. 分离脾细胞:
用滴管向培养皿中注入30滴PBS缓冲液,再用’L’,注