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遗传) ():
碘化钾梯度离心在制备噬菌体中的应用
曾伟强李小兵
(中国科学院遗传研究所,北京)
通过氯化艳梯度离心除去细菌及细,或离心机的
菌残渣来分离纯化噬菌体颗粒是一种方便而有各积转头)离心小时,收集噬菌体颗粒
效的方法〔。其唯一缺点是氯化艳价格昂贵。沉淀。沉淀悬浮于缓冲液中,用电磁
等人〔报道说,可用碘化钾梯度离心法从搅拌器于搅拌过夜。离心分钟
琼脂糖电泳凝胶中回收,发展了以除去不溶解的沉渣。留下上清液做下一步梯
法,在碘化钾溶液中加人,以度离心用。
防止碘离子的氧化,使稳定不受干扰。碘化钾一硫代硫酸钠梯度离心用噬
最近,我们把该法应用于分离纯化兄噬菌体的菌体缓冲液配制新鲜的碘化钾溶液,并加人
重组体,结果表明在噬菌体颗粒的梯度以防一的氧化。铺梯度,由下向
离心纯化过程中,完全可以用碘化钾替代氯化上,其浓度为(饱和的)、
艳。、及沁蔗糖,各层为。最上
.材料重组体,系在层为样品液以装满离心管为限,样品
切点含有插入的外源人肝片段,经不够可加噬菌体缓冲液。于或
我们用一干扰素探针原位杂交法选出来离心机的悬挂式转头(
的阳性株,命名为)慢加速离心小时。
噬菌体的扩增培养取噬菌体
贮备液,用噬菌体缓冲液(
稀释到,取
稀释液与对数生长中期的样品层
细菌混合,于℃保温分钟后,加上
%软琼脂糖胶溶于培养临蔗柑
基中,朽一”℃),铺于的琼脂平皿上,
℃培养小时或过夜。可见噬菌斑近于汇。二
合。向长有噬菌体的平皿注入对数中期
的培养液,用刮勺捣碎软琼脂糖层,然
后吸到三角瓶中(三角瓶含对数
前中期培养菌),并加到浓度。于图右,梯度示意。
左,离心小时后结果。
℃摇动培养过夜。次日,加人外氯仿,并由上到下:样品层, 蔗糖=
继续摇动分钟。离心分二二
钟,收集裂解上清液。裂解液的噬菌体效价

在以上。上清液再经
.
注意,停机时不能用刹车(,不
然会搞混液层。在暗室白光束下可看到于
的碘化钾梯度上部呈乳白色的噬菌体带
(图,用长针头注射器吸取。用透析袋对
噬菌体缓冲液透析过夜(最好透析液加
,并搅动)。透析后用核糖核酸酶
产品)℃消化小时,
再用蛋白酶产品)
℃消化小时。用等体积的新重蒸
并用饱和过的酚提取次。水相加人
体积的及倍体积乙醇(一
沉淀置℃小时以上,离心收集图凝胶电泳澳化乙锭染色结果
沉淀。乙醇沉淀可重复次,以利于+切;+切;
下一步限制性酶切。图为该法提取的中+切;中+切
巾+切。
经舜切割
后的琼脂搪凝胶电泳图谱。对照为经梯度离心的必要。还有, 放置碘化钾溶
切的。从图谱上看该法所得结果液中的时间不要太长,配碘化钾溶液、离心及透
析要在一夭内完成。