微生物学试验目的与要求.doc

实验二细菌生理及外界因素对细菌的影响
目的
掌握细菌的分离培养技术及纯种移种法。
掌握常用热力灭菌法及紫外线消毒灭菌法。
熟悉细菌各种生长现象及细菌代谢产物及物理消毒法。
了解细菌的常用培养基及生物因素对细菌的影响。
内容
基础培养基的制备(自学),细菌移种(部分示教及操作)
细菌生长现象(示教)
分离培养方法——琼脂平板划线法(操作)
细菌代谢产物的检查(操作及部份示教)
常用物理消毒方法(操作)
生物因素对细菌的影响(示教)
一、基础培养基制备及细菌移种
基础培养基制备
:肉汤培养基常用瘦牛肉制成,如无牛肉用牛肉膏代替。
【材料】
牛肉、氯化钠、蛋白胨、氢氧化钠、蒸馏水。
【方法】
①称除去筋膜无油脂的瘦牛肉500克,用绞肉机绞碎后加水1000毫升,搅拌均匀后放置搪瓷锅内,置冰箱过夜,除去液面上的浮油并使牛肉的水溶性养料充分地渗透出来。
②次日取出,煮沸30分钟,用纱布过滤,肉渣中液体应尽量挤净。
③肉汤中加蛋白胨10克,氯化钠5g,搅拌加热使完全溶解,并用蒸馏水补足至1000毫升。
④冷至50℃左右,。
⑤酸碱度调整后,加热10分钟,使肉汤中部分蛋白质及磷酸盐等因加碱与再度加热的影响,而重新凝固沉淀。滤纸过滤,补足失水。重新调整酸碱度。
⑥分装于烧瓶或试管,瓶口或管口加棉塞,包扎后置高压蒸汽灭菌器材内,121℃蒸汽灭菌15~20分钟。冷却,贴好标签,置于燥凉处备用。
注:如用牛肉膏制备肉汤培养基,配方如下:
牛肉膏
蛋白胨 1g
氯化钠
蒸馏水 100ml
以上各种成份混合加热溶解后,即可调整pH,分装灭菌待用。

加2~3克琼脂至100毫升肉汤培养基内。加热融化,过滤,补足失水,分装于试管中。高压蒸汽灭菌后,趁热将试管斜置,冷凝后即成琼脂斜面培养基。或待冷至50~60℃,以无菌操作倾入灭菌的培养皿中,冷凝后即成琼脂平板。
图2-1 制作琼脂平板法

①,加热融化后,用脱脂棉过滤,补足失水。
②分装于小试管(10×100毫米),每管3毫升。高压蒸汽下121℃灭菌15~20分钟后直立冷凝即成。
(二)纯种细菌接种法
(示教)
【材料】
(1)菌种:大肠杆菌琼脂斜面18~24小时培养物。
(2)培养基:琼脂斜面培养基。
【方法】
(1)左手拇指、食指、中指及无名指分别握持菌种与待接种的培养基管(图2-2),使菌种管位左,培养基管位右,斜面部均应向上,勿成水平,以免管底凝结水浸润在培养基表面甚至沾湿棉塞。
图2-2 斜面培养基接种法
(2)右手拇指和食指分别转动两管棉塞,以便接种时易于拔取。
(3)右手执持接种环(姿势与握铅笔似),在火焰中烧红灭菌,欲伸入试管内的接种杆部分亦要迅速通过火焰2~3次以烧去其表面的杂菌。灭菌过的接种环要握持手中,勿再碰及它物。
(4)以右手手掌与小指,小指与无名指分别拔取并挟持两管棉塞,将两管管口迅速通过火焰数次灭菌。
(5)以灭菌并已冷却的接种环伸入菌种管,从斜面上挑取菌苔少许。退出菌种管,再伸进待接种的培养基管,自斜面底轻轻向顶蜿蜒划线或在斜面作上下涂布,慎勿划破培养基表面(图2-3)。沾菌的接种环,进出试管时,均不应触及试管内壁。
(6)接种毕,重新烧红接种环灭菌后放下。两管管口迅速通过火焰2~3次,塞回棉塞并以右手拇、食两指分别将两管棉塞转进至原来位置。37℃孵育18~24小时后观察生长情况。
图2-3斜面培养基蜿蜒划线法(左)及上下涂带法(右)
(示教)
【材料】
(1)菌种:大肠杆菌琼脂斜面18~24小时培养物。
(2)培养基:肉汤培养基。
【方法】
(1)如斜面培养基接种法握持菌种管及待接种的肉汤管。
(2)接种环灭菌冷却后,伸入菌种管挑取少量菌苔退出菌种管,再伸入肉汤管。在接近液面的管壁上轻轻磨研,再沾少许肉汤调和,使菌混合于肉汤中(图2-4)。
(3)接种完毕,接种环重行灭菌后放下。塞好棉塞,37℃孵育18~24小时后观察生长情况。
图2-5 半固琼脂培养基接种法
图2-4液体培养基接种法
(半固体接种法)示教
【材料】
(1)菌种:大肠杆菌琼脂斜面18~24小时培养物。
(2)培养基:半固体琼脂培养基。
【方法】
如斜面培养基接种法握持菌种管及待接种的半固体琼脂培养基。
(2)右手握接种针,灭菌冷却后,以针挑取菌苔。垂直刺入半固体琼脂培养的中心直至接近(但勿触及)试管底,然后循原路退出(图2-5)。