引物设计.ppt

普通引物的设计
%或有连续8个互补碱基同源。
~30bp,一般为20~27mer。引物的有效长度:Ln=2(G+C)+(A+T),Ln值不能大于38,因为>38时,最适延伸温度会超过Taq DNA聚合酶的最适温度(74℃),不能保证产物的特异性。
+C含量: G+C含量一般为40%~60%。其Tm值是寡核苷酸的解链温度,即在一定盐浓度条件下,50%寡核苷酸双链解链的温度,有效启动温度,一般高于Tm值5~10℃。若按公式Tm=4(G+C)+2(A+T)估计引物的Tm值,则有效引物的Tm为55~80℃,其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。
: 引物中四种碱基的分布最好是随机的,不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不应超过3个连续的G或C。
: 引物自身不应存在互补序列,否则引物自身会折叠成发夹状结构牙引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。引物自身连续互补碱基不能大于3bp。
: 两引物之间不应不互补性,尤应避免3′端的互补重叠以防引物二聚体的形成。一对引物间不应多于4个连续碱基的同源性或互补性。
7:.引物的3′端: 引物的延伸是从3′端开始的,不能进行任何修饰。3′端也不能有形成任何二级结构可能。
′端: 引物的5′端限定着PCR产物的长度,它对扩增特异性影响不大。因此,可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5′端修饰包括:加酶切位点;标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等;引入蛋白质结合DNA序列;引入突变位点、插入与缺失突变序列和引入一启动子序列等。
,引物3′端不要终止于密码子的第3位,因密码子的第3位易发生简并,会影响扩增特异性与效率。
10:引物浓度:-
甲基化引物的设计
( b isulfite sequencing PCR, BSP), 对于亚硫酸盐测序引物设计,除了前面的条件外,还应注意两点:
为了区别甲基化DNA和非甲基化DNA, 引物不应含有CpG 位点
引物扩增的产物应包含尽可能多的CpG位点。
对于M SP需要设计2对引物:一对是针对于经亚硫酸氢盐处理的甲基化的DNA; 另一对是针对于经亚硫酸氢盐处理的非甲基化的DNA。
根据甲基化的DNA 为模板的PCR 扩增甲基化的DNA; 根据非甲基化的DNA为模板的PCR 扩增非甲基化的DNA。检测MSP扩增产物,如果用针对处理后甲基化DNA链的引物能扩增出片段,则说明该被检测的位点存在甲基化;若用针对处理后的非甲基化DNA链的引物扩增出片段,则说明被检测的位点不存在甲基化
M SP引物设计的原则: 为了最大限度的区分甲基化与非甲基化, 引物的3端至少包含1个CpG 位点, 我们可以自己设定CpG的 C 距3末端的最远距离。在M ethPrim er 中默认值为3, 即在引物的最后3个碱基中, 至少有1 个是CpG的C 。
引物序列中应包含尽可能多的CpG位点。甲基化引物和非甲基化引物序列3端应处于相同的CpG位点。如果2对引物不在相同的CpG位点退火, PCR 结果就不能准确反映样本DNA甲基化的情况。但是甲基化引物和非甲基化引物可跨越不同的长度, 在起始位点和长度上也可以不同。