食源性病原菌快速检测方法的发展和影响.pdf

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碳源中活的细菌的呼吸可以引起氧化还原作用的改变,这些变化可以用四唑类化合物通过比色进行检测。用分光光度计测量颜色的变化后,再将结果图与计算机中的参考数据库进行对比得出鉴定结果。。部分用于鉴定食源性细菌的小型生化鉴定试剂和自动检测系统系统原理厂商名称鉴定微生物种类API生化BioMerieux肠杆菌、李斯特菌、葡萄球菌、弯曲杆菌、非发酵菌、厌氧菌CobasIDA生化Roche肠杆菌Micro-ID生化REMEL肠杆菌、、弧菌、非发酵菌、厌氧菌Minitek生化BD肠杆菌Microbact生化Microgen肠杆菌、革兰氏阴性菌、非发酵菌、李斯特菌Vitek生化BioMerieux肠杆菌、革兰氏阴性和阳性菌Microlog碳氧化Biolog肠杆菌、革兰氏阴性和阳性菌MIS脂肪酸Microbial-ID肠杆菌、李斯特菌、芽胞杆菌、葡萄球菌、弯曲杆菌Walk/Away生化MicroScan肠杆菌、李斯特菌、芽胞杆菌、葡萄球菌、弯曲杆菌Raplianalyzer生化Oxoid肠杆菌、李斯特菌、芽胞杆菌、葡萄球菌、弯曲杆菌4:..Qualicon沙门氏菌、葡萄球菌、李斯特菌、大肠埃希氏菌CobasMicro-ID生化BD肠杆菌、革兰氏阴性菌、非发酵菌Malthus电导Malthus沙门氏菌、李斯特菌、弯曲杆菌、大肠杆菌、假单胞菌、其它大肠菌群Bactometer阻抗BioMerieux沙门氏菌二、改良和特定培养基类多,特殊培养基到传统方法的简单改良等等,其目的都是为了节省人力、时间和材。如Petrifilm,这种检测方法使用含有干粉培养基的一次性纸板为材料,用于总的细菌、特定细菌、霉菌和酵母菌的计数。这一检测方法无需制备培养基和琼脂平板,从而节省了储存和培养空间,也简化了废弃材料的处理过程。Isogrid检测方法使用了特殊设计的疏水格式膜过滤器(HGMF),可以滤过高浓度细胞悬液,从而减少了过滤前悬液稀释的次数。与常规使用的滤膜80CFU/ml的技术能力相比,HGMF的技术能力达到了1600CFU/ml。另外还有两项方法对这一领域的发展也起了较大影响,一种是在培养基中加入特殊底物使其能够快速检测酶活性的变化;另外一种是基于细菌ATP活性变化来计算总的细菌数。多年来,pH指示剂一直用在培养基中以测定因细菌新陈代谢活动引起的酸度变化。然而,显色和荧光底物可以用来快速检测特异性酶的活性。有些底物只针对一定的细菌或菌属,因此可以对特定的微生物进行快速的初步鉴定。ONPC和X-Gal等一些显色底物已被加入培养基中用来检测肠道细菌中的-半乳糖苷酶(GAL)的活性;类似的还有被添加到各种培养基中对大肠杆菌β-葡糖苷酸酶(GUD)活性进行特异性检测的荧光底物MUG。现在,许多特殊显色培养基,包括浸有底物的圆盘型纸片培养基,均加有MUG或其它显色的GUD底物用来检测大肠杆菌。其中较为突出的是用来初步分离大肠杆菌O157:H7或其它肠出血性大肠杆菌(EHEC)的特殊显色培养基。这些培养基通常混合有检测GAL、GUD或山梨醇发酵的不同显色底物,这样当不同的细菌在这些培养基上生长时可以形成颜色各不相同的菌落。。检测细菌ATP活性的生物发光技术也已在食品检测中得到了广泛应用。这些检测方法的关键组分在于荧光素酶、虫荧光素盒镁离子。在ATP的作用下,虫荧光素被氧化成氧化虫荧光素,同时释放出光子。光子释放的数量可以用发光仪进行定量检测。当采用ATP作为限制性试剂时,光子释放的数量就与原始标本中估计的细菌数目成直接正比关系。荧光素酶反应速度很快,并且它不像其它方法一样需要增菌培养,ATP检测方法可在不增菌的情况下、在5到10分钟之内检出104CFU/ml的细菌。这些方法对监测食品或食品加工中的卫生质量十分有效;然而由于所有有生命的生物体都可产生ATP,所以这些分析方法只能用来估算总的细菌数,而不能判定是否有特定细菌或病原菌存在。-1ATPNewHorizonBiotraceATPBiotraceLightningATPIdexx5:..3MSimPlate培养基Idexx大IsogridHGMF/MUGQALabsPetrifilm纸片培养基3MSimPlate培养基IdexxRedigel培养基RCRScientificColiQuikMUG/ONPGHachColiBlue培养基HachColilertMUG/ONPGIdexxLST-MUGMPN培养基Difco,GIBCOpleteMUG-X-GalBioControlColitrakMPN-MUGBioControlColiGel,E*ColiteMUG-X-GalCharmSciencesCHROMagar培养基CHROMagar大肠杆菌MUGdiscMUGREMELCHROMagar培养基CHROMagarEHECRainbowAgar培养基BiologBCMO157:H7培养基BiosynthFluorocultO157:H7培养基Merck产单核细胞李斯特菌BCM培养基Biosynth沙门氏菌属IsogridHGMFQALabsOSRT培养基/动力Unipath(Oxoid)Rambach培养基CHAROMagarMUCAPC8酯酶BiolifeXLT-4培养基DifcoMSRV培养基耶尔森氏菌属Crystalviolet染色Polysciences三、核酸检测方法,商品化的用于检测食源性病原菌的方法只有DNA、PCR和噬菌体技术种。近来,DNA分子记录方法得到了长足的发展,这些方法包括脉冲凝胶电泳、限制片断长度多态性和核糖记录(ribotyping)等。记录法对流行病学调查和了解食源性病原菌的特征及“指纹”识别对应病原菌具有很高的应用价值。但由于分子记录法不在本章所涉及的范围之内,所以在此不做详细论述。。1987年,在一个关于诊断领域未来市场机遇的会议上,许多专家都乐观地认为DNA探针技术将在全球范围内成为食品工业中占主导地位的诊断工具。但实际上探针技术的商业化发展却出奇地缓慢,究其原因可能是最初在探针技术上使用了放射性标记物。虽然DNA探针检测技术已经被开发出来用于主要的食源性病原菌的检测,但只有少数几家公司在积极推广这种用于食品检测的技术。探针技术检测的对象主要为rRNA,这是因为细菌rRNA的高复制量为探针检测提6:..然的增对象,探检测rRNA也因此具有了的灵敏度。GENE-TRAK检测试剂将DNA杂交技术和酶免疫检测技术(EIA)合在一起对食源性病原菌进行检测。它主要由带有多聚腺嘌呤核甘尾部捕捉探针和荧光素标记的测定探针构成,二者可与目标rRNA的邻近区域发生特异性结合()。食品标本通过增菌和细胞化学溶解后,目标rRNA就会同时与两种探针进行杂交,然后杂交体固定在包被有多聚胸腺嘧啶核甘的测定仪上。将未结合或非特异性结合的杂交物洗去,然后用过氧化酶标记的抗荧光素抗体和一种比色过氧化酶底物构成的EIA方法检测结合物。)-TRAK试剂的DNA探针检测原理。(A)捕捉探针和测定探针与目标rRNA杂交。(B)测定仪捕捉杂交体。GEN-uProbe检测试剂是一种杂交保护试剂。它采用一个化学发光吖啶酶标记的单链探针,与16SrRNA的特定序列进行杂交。由于不同的水解作用可使未结合的探针失活,所以杂交保护了探针和标记物。随后加入的碱性HO可以激活标记物使其在430nm22处发光,并由发光计定量测定。AccuProbe试剂主要用于细菌纯培养基分离物的鉴定,但也试验性地用于食品增菌标本中的病原菌检测。-TRAK及其它一些商品化的核酸检测试剂。部分商品化的检测食源性原菌的核酸检测试剂有机生物名称商品名原理制造商肉毒梭菌ProbeliaPCRBioControluProbeProbeGEN-PROBEGENE-TRAKProbeGEN-TRAK大肠埃希氏菌GENE-TRAKProbeGRN-TRAK大肠杆菌0157:H7BAXPCRQualiconProbeliaPCRBioControl李斯特菌属GENE-TRAKProbeGENE-TRAKAccuProbeProbeGEN-PROBEBAXPCRQualiconProbeliaPCRBioControl沙门氏菌属GENE-TRAKProbeGENE-TRAKBAXPCRQualiconBINDPhageBioControlProbeliaPCRBioControluProbeProbeGEN-PROBEGENE-TRAKProbeGENE-TRAK小肠结肠耶尔森氏菌GENE-TRAKProbeGENE-,但在探针技术中使用的杂交基本原理却在其它技术中得到了应用。PCR实验中,DNA(探针)或引物与特定靶序列或模板进行杂交,然后在Taq聚合酶作用下在热循环中进行扩增。PCR是一种用途极为广泛的技术,可以在很短的时间内将一段特定序列进行大量扩增。PCR可以同时检测多个目7:..PCR剂的开发工作有许多予了讲述。理论上,PCR可在个小时之内把一个单拷贝DNA扩增一百万倍,所以它可以消除或大大降低对增菌培养的依赖性。然而尽管发表了大量有关PCR在食源性病原菌检测中的应用方面的文章,但商品化的试剂盒却寥寥无几()。这也许部分归咎于这样一个事实,象其它方法一样,PCR试剂也受到了食品结构复杂的影响。由于PCR技术具有极高的敏感性,所以并不需要每次都使用细菌纯培养物,但在PCR实验前进行增菌培养仍然是需要的。食品中的抑制剂是干扰PCR结果的主要原因,抑制剂可以影响引物的结合、扩增效果或出现假阴性结果。在临床试验中,粪便、血便和血液标本中PCR抑制剂的出现已得到了分认定。此外,在对环境标本的检测中发现,土壤中的腐殖质和铁类化合物的存在也可影响引物的结合或抑制PCR的扩增。在应用PCR检测食源性的过程中,富含高蛋白和脂肪成分的食品,如鸡、肉类、软奶酪和牡蛎等,可在很大程度上干扰PCR的扩增。其原因可能在于这些食品标本有蛋白酶存在,蛋白酶可降低Taq酶的活性。但也有一些例外,比如豆芽中脂肪很少,但它也抑制PCR的扩增。除食品成分外,在增菌和培养基中过量使用的一些原料和从食品标本中抽提DNA时使用的化合物也可干扰PCR。所以食品标本和增菌培养后的标本常常需经过处理或抽提,使其成为适合PCR实验的DNA模板。另外,由于食品本身的复杂性,针对一种特定食品的准备方法对其它食品可能并不适合。例如,在碱性条件下和使用去垢剂进行抽提可以降低高脂肪和高蛋白食品对PCR的抑制效应;但其它食品可能需要采取稀释、洗涤、过滤或离心等步骤来消除抑制效应。兰茨等人总结了一些有效的预处理方法,这些方法可以用于经过选择的食品、土壤和临床标本使其适合PCR。此外,采用抗体捕捉和浓缩特定细菌的免疫磁分离技术可有效降低食品对PCR的抑制效应,从而推动PCR技术在检测食品、环境和临床标本中的应用。除PCR外,还有正在开发的其它一些检测食源性病原体的DNA扩增方法,如连接酶链反应和自我序列复制(3SR)技术等。体技术噬菌体与宿主细菌间的高特异性相互作用使其可以被用来检测食品中对应的病原菌。最典型的就是生物发光和冰核技术。如上所述,检测ATP的方法并不能区分细菌种类,它们主要用来测定食品或卫生设施中的细菌总数。但是如果在生物发光试验中采用基因工程技术构建的携带有检测标记的特异性噬菌体,那么就可以用生物体发光技术鉴定细菌。互生单细胞菌属、发光菌属核弧菌属中的几个菌种携带有Lux操纵子,可以编码细菌荧光素酶而自然发光。例如研究人员将来自fischeri弧菌的Lux基因克隆道Charon30噬菌体中并以此开发出了特异性检测大肠杆菌的试剂。由于噬菌体本身并没有基因表达的机制,所以Lux基因是静止基因。但一旦重组的噬菌体感染其诉诸,插入的Lux基因就会在很短的时间内表达,从而使宿主发光。发光量可用发光仪进行测定并校准以反映标本中原始杆菌的总数。在不需要增菌的条件下,重组的Charon噬菌体可在感染后100分钟内检测出10个左右的大肠杆菌,在1小时内从牛奶或尿液中检测出102到103个细胞。利用Lux重组噬菌体检测沙门氏菌纯培养悬液也取得了类似的敏感性结果。但由于所要求的沙门氏菌检测极限为25克食品中有一个细菌,所以在生物发光试验中仍需要做一个短暂的增菌培养。另一种噬菌体检测方法是用于沙门氏菌属检测的细菌冰成核诊断(BIND)技术。该方法基于结冰的物理特性,采用ina基因使冰成核。将少量、均一体积的水超冷却至-40℃并保持液态不变;当有成核剂存在时,会在-2℃时形成冰晶体。多数冰核是无机分子,但有些植物性致病菌如欧文氏菌属、假单细胞菌属和嗜麦芽黄单胞菌属,可产生形成冰核的蛋白质。基因编码的冰成核蛋白似乎可以结合水分子冰模拟冰晶体的结构,促使结冰现象的发生。把ina基因克隆到对沙门氏菌特异的噬菌体中,这样当食品中有沙门氏菌存在时,就可8:..指染进行检测。据验报告,BIND方法检测灵敏度最低可达20CFU/ml,但一般在102和104CFU/ml之间,它取决于所检测的沙门氏菌血清型的不同。所以要获得理想的检测,仍需要增菌。冰成核技术除了用于检测分析之外,许多工厂也在对这一技术进行研究以使其能够提高食品的冷冻温度,减少冷冻所需时间以提高冷冻食品的质量、口感等。检测方法抗体多年来一直被用来对细菌进行血清学分型。最早的抗体分型出现在1920到1930年之间,用来鉴定沙门氏菌血清型。反射免疫技术的发展扩大了抗体的使用范围,使其可以对抗原进行定量测定。但直到酶联免疫吸附试验(ELISA)等高敏感度检验方法问世后,抗体在检测分析技术中的潜力才得到确认。抗体—特别是单克隆抗体的高特异性结合能力,抗原抗体反应的简便性和用途多样性等特性促使了各种检测方法的建立。一般而言,抗体检测方法有五中类型,在食品检验中使用的快速检测方法主要是由这些方法构成的。(LA)。在胶乳凝集试验中,采用包被有抗体的彩色胶乳颗粒或胶体金颗粒家测细菌细胞悬液。如果悬液中有特异性抗原存在,就可形成肉眼可见的凝集或沉淀()。虽然凝集反应非常简便快速,但灵敏度不高,反应约需要107CFU。但即便如此,它的灵敏度也比传统的血凝或细胞凝集试验提高了10到100倍。用于细菌毒素分析的方法叫做方向被动胶乳凝集(RPLA),反应通常在酶标板内进行。LA和RPLA的主要区别是前者检测的抗原(细菌细胞)是不溶性的,而后者的抗原(毒素)是可溶性的,所以二者的阳性结果判断是不一样的。食品分析中,虽然用LA检测沙门氏菌属已得到了认可,但检测前需要进行多步骤的增菌,而且有时候悬浮的食品颗粒也会影响对凝集结果的判断。LA主要用于对从食品中分离出的菌落进行快速血清学鉴定或确定,而RPLA则多用于对食品萃取物中的毒素或纯培养菌株产生的毒素进行测定。():上图所示为胶乳凝集原理,即通过特异性抗原抗体胶乳凝集原理,即通过特异性抗原抗体胶乳的相互作用,形成了凝集或凝块。,目前使用这种方法的商品化试剂只有沙门氏菌1-2检测方法,它是Ouchterlony试剂的改进型。它不使用凝胶载体,而是采用一个两舱、L形的装置()垂直舱(活动舱)内含有半固体琼脂,舱的顶部接种有一种抗沙门氏菌鞭毛抗原的特异性抗体。水平舱(接种舱)含有选择性增菌培养基,可以相等比例接种前增菌肉汤。如果有能运动的沙门氏菌存在,它们就会在有选择性增菌培养基的水平