同工酶实验宁波大学.ppt

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演讲人姓名
理解同工酶的概念及遗传学意义
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学习聚丙烯酰胺凝胶电泳原理
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掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳操作技术
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掌握乳酸脱氢酶同工酶及酶活性染色
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实验目的：
同工酶是指能够催化相同的化学反应，但酶分子结构、理化特性乃至免疫学性质不同的一组酶。 它们是由遗传体系决定的在不同组织中表达的蛋白质作用相同,但分子结构、理化特性等不同.
由于同工酶存在蛋白结构及理化性质的不同，在电泳时条带略有差异,因此可用电泳将它们分离开来。
本实验做的是乳酸脱氢酶的分离鉴定
乳酸脱氢酶
用电泳方法将LDH同工酶分离，分析其酶谱，发现脊椎动物各组
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织中有五条酶带。每条酶带的酶蛋白都是由四条肽链组成的四聚
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体，LDH有两类肽链，A（M）或B（H），各有不同 同工酶的
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免疫性质，按排列组合可形成符合于电泳酶带数的五种同工酶。
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LDH1及LDH5分别由纯粹的4条B链（B4）和4条A链（A4）形
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成，称为纯聚体；而LDH2、LDH3和LDH4都是由两类肽链杂交
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而成的，分别可写成AB3、A2B2、A3B，称为杂交体
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聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质的原理
净电荷聚丙烯酰胺凝胶电泳是对天然状态生物大分子进行的电泳，利用蛋白质分子中所带净电荷、分子质量、形状的差异，而在电场中泳动的速度和方向不同，达到分离的目的。
实验器材：
夹心式垂直板电泳槽，梳子，直流稳
压电源（电压300-600V，电流50-
100mA），移液枪（各种量程），烧杯
（100mL），培养皿,
实验流程
试剂的配制
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仪器的准备
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动物组织的样品的获取
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分离胶（30分钟）
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浓缩胶（30分钟）
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电泳（2-3小时）
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染色（30分钟）
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观察结果
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一、试剂：
：
Ａ储备液：
Tris~HCl缓冲液：1 M HCl 48ml， Tris，加双蒸水到 80ml，。
Ｂ储备液 ：
Tris~HCl缓冲液：1 M HCl 48ml， Tris，加双蒸水到80ml，。
Ｃ储备液：
分离胶储备液（30% Acr/Bis）：30g Acr， Bis，用双蒸水定容到100ml，备用，4℃存放可以保存1个月。
Ｄ储备液：
浓缩胶储备液：10g Acr， Bis，用双蒸水定容到100ml，备用，4℃可以保存1个月。
Ｅ储备液： 10% Aps（W/V）：1g定容到10ml，-20℃保存。
Ｆ储备液： 40%蔗糖：40g蔗糖溶解到60ml双蒸水中。
TEMED
：
， ，定容到1000ml，使用时稀释10倍。
样品制备
取材：　大黄鱼若干条，、、、、、、、　放入冰箱保存。
提取酶：取不同组织块，加入提取缓冲液Tris-Hcl(pH=) 此溶液需４℃预冷，组织重量（g）与缓冲液体积（mL）之比为１：5,用研钵研磨充分。浆液４℃离心约３０分钟，１５０００转／分钟。
取上清液至新管，吸取其中150ul样品，加１００ul 甘油
和１０ul溴酚蓝，混匀之后即可点样。
分离胶的制备
将需要的凝胶储备液从冰箱中取出，放置备用。取一100ml烧杯，按表比例混匀之后使用。
配方表
储备液
A储备液
C储备液
E储备液
双蒸水
TEMED
总体积
用量（ml）




10ul
20