T GXAS 488-2023 A型塞尼卡病毒与O型、A型、亚洲I型口蹄疫病毒鉴别检测方法.docx

该【T GXAS 488-2023 A型塞尼卡病毒与O型、A型、亚洲I型口蹄疫病毒鉴别检测方法 】是由【1772186****】上传分享，文档一共【11】页，该文档可以免费在线阅读，需要了解更多关于【T GXAS 488-2023 A型塞尼卡病毒与O型、A型、亚洲I型口蹄疫病毒鉴别检测方法 】的内容，可以使用淘豆网的站内搜索功能，选择自己适合的文档，以下文字是截取该文章内的部分文字，如需要获得完整电子版，请下载此文档到您的设备，方便您编辑和打印。ICS
CCS B 41
t/gxas
标 准
T/GXAS 488—2023
A型塞尼卡病毒与。型、A型、亚洲I型口
蹄疫病毒鉴别检测 多重RT-PCR和多重
qRT-PCR 法
Estab I i shment of multiplex RT-PCR and multiplex qRT-PCR for d i ff erent i a I
detect i on of senecav i rus A and serotype 0, A, As i a I foot-and-mouth
d i sease v i rus
2023 - 05 - 10 发布
2023 - 05 - 16 实施
广西标准化协会 发布
附录C
（资料性）
重组质粒标准品制备
C. 1特异性引物
特异性引物序列见表A. 1和表B. Io
C. 2多重RT-PCR重组质粒标准品的制备
以人工合成的含有SVA目的片段，以及。型、A型、亚洲I型FMDV疫苗株的cDNA为模板，应用 特异性引物进行PCR扩增,分别获得157bp、240bp、320bp和460bp的目的片段。经回收PCR产物, 连接pMD18-T载体，转化DH5 a感受态细胞，阳性克隆增菌培养后提取质粒。经测序鉴定正确后，获得 的重组质粒分别命名为pSVA-3D、p O-VPK pAsia I-VP1及pA-VPl,选取终浓度均为2. 5X 10,拷贝/吐 的重组质粒混合物作为质粒标准品。
-PCR重组质粒标准品的制备
提取SVA以及。型、A型、亚洲I型FMDV病毒液的RNA,反转录成cDNA后作为模板，应用特异 性引物进行PCR扩增,分别获得70bp、lllbp、64bp和71bp的目的片段。回收PCR产物、连接pMD18-T 载体，转化DH5 a感受态细胞，阳性克隆增菌培养后抽提质粒，经测序鉴定正确后，获得的重组质粒分 别命名为qpSVA-3D、qp O-VPK qpATPl、qpAsia I-VP1,选取终浓度均为2. 50义10,拷贝/心 重组质 粒混合物作为质粒标准品。
目 次
刖舌 II
1 范围 1
2规范性引用文件 1
3缩略语 1
4 原理 1
5试验条件 1
6 试剂 2
7主要仪器设备 2
8样品采集与处理 2
多重RT-PCR检测 2
多重qRT-PCR检测 3
11阴性及阳性对照 3
12 结果判定 4
附录A （资料性） 多重RT-PCR引物序列及检测电泳图 5
附录B （资料性） 多重qRT-PCR引物探针及扩增曲线图 1
附录C （资料性） 重组质粒标准品制备 2
本文件按照GB/T 1. 1-2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。
本文件由广西兽医协会提出并归口。
本文件起草单位：广西壮族自治区动物疫病预防控制中心、广西农垦永新畜牧集团西江有限公司、 广西中科基因科技有限公司、广西民生中检联检测有限公司。
本文件起草人：施开创、屈素洁、林昌华、冯淑萍、黄海愉、龙凤、文金华、尹彦文、张胜斌、文 愈、宋靖萱、蒋家霞、陆文俊、谢守玉、黄美芝、李军。
A型塞尼卡病毒与。型、A型、亚洲I型口蹄疫病毒鉴别检测 多重
RT-PCR 和多重 qRT-PCR 法
1范围
本文件规定了用于A型塞尼卡病毒与。型、A型、亚洲I I型口蹄疫病毒的鉴别检测的多重RT-PCR 和多重qRT-PCR法，包括原理、试验条件、试剂、主要仪器设备、样品采集与处理、多重RT-PCR检测、 多重qRT-PCR检测、阴性及阳性对照和结果判定等技术耍求。
本文件适用于A型塞尼卡病毒与。型、A型、亚洲I型口蹄疫病毒核酸的检测。
2规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本 文件。
GB/T 18935 口蹄疫诊断技术
GB 19489 实验室生物安全通用要求
NY/T 541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范
3缩略语
下列缩略语适用于本文件。
SVA： A 型塞尼卡病毒(Senecavirus A)
FMDV： 口蹄疫病毒(Foot-and-Mouth Disease Virus)
RT： 反转录 (Reverse Transcription )
PCR：聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction)
RT-PCR：反转录聚合酶链反应(Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction)
qRT-PCR:实时荧光定量反转录聚合酶链反应(Quantitative Real-time RT-PCR)
Ct值：每个反应管内的荧光信号量达到设定的阈值时所经历的循环数(Cycle threshold)
4原理
根据SVA和。型、A型、亚洲I型FMDV基因特定序列的保守区域，合成四对特异性引物所建立 的多重RT-PCRo
经反转录酶的作用，从RNA合成cDNA,再以cDNA为模板，在DNA聚合酶作用下扩增 合成目的片段，通过琼脂糖电泳的电泳条带分子量大小进行结果判定。
根据SVA和。型、A型、亚洲I型FMDV基因特定序列的保守区域，合成四对特异性引物和四条 特异性的荧光双标记探针所建立的多重qRT-PCRo Taqman探针两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬 灭荧光基团。在PCR扩增时，探针被酶切降解，使报告荧光集团和淬灭荧光集团分离，就形成可被仪器 接受的荧光信号，通过标准曲线对未知模板进行定量分析。
5试验条件
进行SVA和。型、A型、亚洲I型FMDV实验室检测时，如样品处理、核酸提取等，应按GB 19489 执行。
6试齐U
引物和探针
引物和探针序列见表A. 1和表B. 1,引物和探针的使用浓度均为20 pmol/pLo
RNA提取试剂盒
宜选取商品化的RNA提取试剂盒。
3 PCR和qRT-PCR扩增试剂
应按照普通PCR仪和实时荧光PCR仪的不同型号选取合适的PCR和qRT-PCR扩增试剂。

宜选取商品化的反转录试剂盒、胶回收试剂盒和电泳缓冲液。
7主要仪器设备
生物安全柜、普通PCR仪、实时荧光PCR仪和凝胶成像系统。
8样品采集与处理
1样品米集
组织样品、水泡液、食道-咽喉分泌物(0-P液)等样品采集按NY/T 541执行。

组织样品、水泡液、。-P液等样品处理按GB/T 18935执行。
3待检样品RNA提取
取200 ML待检样品于无RNA酶的1. 5 mL离心管中，按照RNA提取试剂盒操作说明书抽提RNA。
9 多重RT-PCR检测
1反转录(RT)
9. 1. 1提取样品RNA后，以样品RNA为模板，按表1的反转录体系进行反转录。
表1反转录体系
试齐IJ
体积
5XRT缓冲液
AMV反转录酶(5U/pL)
0. 5 pL
dNTP混合物(各lOmM/L)
1 ML
RNA酶抑制剂(40U/|nL)
0. 5 pL
随机引物6聚体(50 pmol/pL)
1. 5 pL
待检总RNA模板
5 g
灭菌双蒸水
补足总体积至50 ML
加完试剂后瞬时离心混匀。将PCR反应管置于普通PCR仪内进行反转录。反应程序为：30 ℃, 10 min； 48 ℃, 45 min； 95 ℃, 5 min。获得的cDNA直接用于多重PCR扩增，或置-20 ℃保存备用。
2 多重PCR扩增

反转录后，以获得的cDNA为模板，建立25aPCR反应体系。在冰浴条件下，在PCR反应管中按表 2用量分别加入各成分。
表2多重PCR扩增体系
试剂
体积
2 x TaqPCR MasterMix
此
SVA和。型FMDV上游、下游引物(ZOpmolaL)
各 0. 75(1L
亚洲I型和A型FMDV上游、下游引物(20pmol/RL)

cDNA模板

灭菌双蒸水
补足总体积至25
9. 2. 2 多重PCR反应
加完试剂后瞬时离心混匀。将PCR反应管置于普通PCR仪内，设置如下反应参数：94 ℃ 3 min； 然后94 ℃ 30 s, 58 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s,循环40次；最后72 ℃ 10mino PCR产物直接用于电泳，或置4 ℃ 保存备用。
多重qRT-PCR检测
1反应体系的配制
应在配液区配制。采用20此反应体系，扩增体系见表3。
表3多重qRT-PCR扩增体系
试齐IJ
体积
Premix Ex Taq ( Probe qPCR )
10 |iL
SVA、A型及亚洲I型FMDV上游、下游引物(20 pmol/gL)
各0. 5比
SVA、A型及亚洲I型FMDV探针(20 pmol/gL)
各 0. 4 pL
0型FMDV特异性上游、下游引物及探针(20 pmol/gL)
各 0. 3 pL
样品RNA
2比
灭菌双蒸水
补足总体积至20比
多重qRT-PCR反应
在实时荧光PCR仪上选用CY5、FAM、TXR和J0E通道，设置如下反应参数：42 ℃反转录15 min, 95 ℃预变性30 s；然后95 ℃ 5 s； 58 ℃ 34 s, 40个循环。在每次循环的退火延伸时分别收集CY5、 FAM、TXR和JOE通道的荧光信号。
11阴性及阳性对照
1阴性对照
用灭菌双蒸水作为阴性对照。

用重组质粒pSVA-3D、pO-VPK pAsia「VP1及pA-VP1混合物作为阳性对照，重组质粒的制备方 法见附录Co
12结果判定
多重RT-PCR结果判定
PCR扩增产物的电泳检测
1倍电泳缓冲液中，加热充分溶化后，待凝胶温度降至50 ℃〜60 ℃, 加入10叱核酸染料，倒入胶槽制备凝胶板。在电泳槽中加入电泳缓冲液，使液面刚刚没过凝胶。取5 叱〜10 ALpCR扩增产物分别和1叱的6倍上样缓冲液混合后，分别加样到凝胶孔。100V恒压下电泳30 min,用凝胶成像系统观察结果。
电泳结果判定
. 1当阴性对照无任何扩增带，而阳性对照在460 bp、320 bp、240 bp和157 bp位置出现扩增 带，则实验结果成立；否则，此次检测无效。
被检样品在157bp位置出现扩增带，判定为SVA阳性；若被检样品在157bp位置未出现扩 增带,判定为SVA阴性。
被检样品在240 bp位置出现扩增带，判定为。型FMDV阳性；若被检样品在240 bp位置未 出现扩增带，判定为。型FMDV阴性。
被检样品在320 bp位置出现扩增带，判定为A型FMDV阳性；若被检样品在320 bp位置未 出现扩增带，判定为A型FMDV阴性。
若被检样品在460bp位置出现扩增带，判定为亚洲I型FMDV阳性；若被检样品在460bp位 置未出现扩增带，判定为亚洲I型FMDV阴性。
注：多重RT-PCR检测电泳图见图A. 1
-PCR结果判定
12.
根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过正常阴性对照样品扩增曲线的最高点为准。
12.
2. ＞ 35o
28,并出现典型的S型扩增曲线。否则，此次检测无效。
12.
12. 2. ，且Ct值W 35,判定为SVA阳性；否则，判定为SVA阴 性。
12. 2. ，且Ct值W 35,判定为。型FMDV阳性；否则，判定 为。型FMDV阴性。
12. 2. ，且Ct值W 35,判定为A型FMDV阳性；否则，判定为 A型FMDV阴性。
12. 2. 3. 4被检样品在J0E通道出现扩增曲线，且Ct值W 35,判定为亚洲I I型FMDV阳性；否则，判 定为亚洲I I型FMDV阴性。
注：多重qRT-
附录A
(资料性)
多重RT-PCR引物序列及检测电泳图
A. 1多重RT-PCR引物序列
见表A. Io

引物名称
引物序列(5, -3')
扩增片段长度(bp)
SVA-F
CTACTTCAAACCAGGAACACT
157
SVA-R
ACAAGGCCCTCCATCT
FMDV-O-F
GTCCAGAGACGCCAACACACG
240
FMDV-O-R
GGTGTTGTCCAACGCTGTCTCG
FMDV-A-F
AGCCCCACGCACGTCATTGAC
320
FMDV-A-R
ACCCGCGCCGCGAGAGACC
FMDV-Asial-F
AGCCCAAGAGCACCCAAACCC
460
FMDV-Asial-R
ACGGCGGTCTTGTGTGGTGTC
2多重RT-PCR检测电泳图
见图A. 1。
20008
4
1-
500bp
250bp
1008
460bp
*“p 240bp 157bp
M
注：M： DNA分子量标准；1：阳性对照；2： O型FMDV ( + ) ； 3：亚洲I型FMDV ( + )；
4： A 型 FMDV ( + ) ； 5： SVA ( + ) ； 6：阴性对照
图A. 1多重RT-PCR检测电泳图