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干扰素 α2b生产工艺争论及行业分析
1 前言
干扰素是 1957 年英国科学家 Isaccs 等觉察的。他们把灭活的流感病毒作用于小鸡细胞，结果觉察这些细胞产生了一种可溶性物质，这种物质能抑制流感病毒，并且能干扰其它病毒的生殖，因此，他们将这种物质称为“干扰素”。以后科学家们进一步觉察，机体对入侵的异种核酸〔包括病毒〕都产生干扰素以进展防范。当机体细胞受到病毒感染时，机体细胞产生干扰素，干扰病毒复制，它是机体抗病毒感染的防范系统。
干扰素是一种细胞因子。它是机体感染病毒时, 宿主细胞通过抗病毒应答反响而产生的一组构造相像、功能相近的低分子糖蛋白。干扰素干扰病毒复制, 它是机体抗病毒感染的防范系统干扰素的种类很多，有人体干扰素、动物干扰素、昆虫干扰素、植物干扰素和细胞干扰素。[1]
目前所知道的人体干扰素按细胞构造和来源分 α、β、γ 干扰素三个型别, α 干扰素又称人白细胞干扰素，它是由 B 淋巴细胞和单核细胞产生的,它可以分为23 种亚型,分别称为干扰素 α1、α2a、α2b、α3 等，它们相互之间有较高的同源性。[2]人 β-干扰素是人纤维母细胞产生的, 只有一个亚型。γ 一干扰素又称免疫干扰素,它是由淋巴细胞的关心诱导细胞产生的,与 α、β 干扰素之间没有明显的同源性。三种干扰素都有抗病毒、抗肿瘤及免疫调整活性。
干扰素不能直接灭活病毒，而是通过诱导细胞合成抗病毒蛋白〔AVP〕发挥
效应。干扰素首先作用于细胞的干扰素受体，经信号转导等一系列生休过程，激
活细胞基因表达多种抗病毒蛋白，实现对病毒的抑制作用。抗病毒蛋白主要包括
2′-5′A 合成酶和蛋白激酶等。前者降解病毒 mRNA、后者抑制病毒多肽链的合成，
使病毒复制终止。
近年来在国际上抗病毒和抗癌症的争论领域中,更多地在开发自然的免疫调整和抗病毒物质,干扰素作为一种自然的人体抗病毒蛋白质受到人们的关注。干扰素将要成为 21 世纪抗病毒、抗癌症最为广泛的药物之一[3]。α 干扰素是迄今为止治疗慢性乙肝的首选抗病毒药物, 一般肝炎治疗药物的显效率在 20%-30%左右。干扰素代表了慢性肝炎药物进展的方向。它还是治疗丙肝的唯一有效抗病毒
药物, 它又是临床上应用最广的治疗肿瘤的细胞因子。它的适应症主要有病毒性皮肤性病、慢性子宫颈炎、呼吸道病毒感染及妇科疾病、疙疹、造血系统恶性肿瘤和淋巴瘤。β-干扰素用于复发的多发性硬化症，用于静脉注射使用。γ-干扰素主要治疗类风湿性关节炎。γ-干扰素在免疫调整功能方面较 α、β-干扰素强 1000 倍, 不仅可以增加免疫功能, 还可以调整自身免疫性疾病免疫过渡到接近正常水平[3]。干扰素还应用于生殖道衣原体感染、浅表膀胱癌、锋利湿疣、皮肤病、血液系统疾病、艾滋病相关综合征等的治疗。世界上已有很多国家批准生产使用重组干扰素制剂,用于治疗多种疾病。经过临床应用治疗说明,用干扰素治疗,一般无
[4]。
然而，传统的从动物中提取血源性干扰素由于来源有限及技术资金方面问题而无法大量合成。随着生物技术的进展,通过先进的基因工程技术,可以在人体外大规模生产干扰素。
所谓基因工程技术生产干扰素，是指从人细胞中克隆出干扰素基因, 将此基
因与大肠杆菌表达载体连接物构成重组表达质粒, 然后转化到大肠杆菌中, 从而
获得高效表达人干扰素蛋白的工程菌, 工程菌经发酵后可收集到大量菌体, 将菌
体裂开, 用先进的生物工程手段将干扰素蛋白从菌体分别、纯化，得到高纯度的
人基因工程干扰素。基因工程干扰素的消灭, 是干扰素争论工作的一项重大突破
它使得干扰素能进人大规模产业化生产,人们能获得大量活性高、疗效好的干扰
素[1]。
基因工程干扰素具有无污染,安全性高,纯度高,比活性高,本钱低,疗效精准等优点。如今临床应用的需求量越来越高，如何使基因工程干扰素大规模产业化生产成为了重要课题。想要推广干扰素的使用,必需建立高效生产干扰素的体系[4]。
重组人干扰素 α1b 是世界上第一个承受中国人基因克隆和表达的基因工程药物，也是到目前为止唯一的一个我国自主研制成功的拥有自主学问产权的基因工程一类药。
2 干扰素的生产工艺
体外诱生干扰素制备工艺
分析近十年来干扰素的生产工艺及市场概况，对于将来干扰素的进展前景及市场走向具有重要意义。
1
3
动物无限细胞系培育生产工艺
承受仙台病毒诱导人白细胞，进展肯定的分别纯化手段得到干扰素产品。由此生产工艺生产的干扰素 IFNα-n3/Alferon1989 批准上市，但其产量低，生产 1g IFNα，需要 3 亿 ml 人血白细胞。来源困难，工艺简单，收率低，价格昂贵，存在潜在的血源性病毒污染的可能性。
人源转化细胞系培育生产工艺
该工艺首次实现干扰素的大规模商业化生产。1999 年 IFN α-n1/Wellferon 批准用于临床。但由于其活性低，渐渐退出临床应用。
基因工程大肠杆菌发酵生产工艺
此工艺运用发酵过程，通过先变性后复性的纯化手段大规模生产干扰素。表达产物无糖基化，N-met，无活性包涵体。
重组人干扰素 rhuIFN 上市产品一览表
1986
1990
1993
2025－2025
rhuIFNα-2a
rhuIFNα-2b
rhuIFNγ-1b rhuIFNβ-1b
PEG 化 IFN
PEG-Intron
Pegasys
工艺承受分泌表达，产量低，本钱高，过程严格。上市产品有rhuIFN β-1a。如 Avonex(Biogen)〔1996〕，Rebif(Serono)〔2025〕。表达产物：166 aa 糖基化蛋白， ku。
基因工程假单胞杆菌发酵生产工艺
该工艺承受腐生型假单胞杆菌〔Pseudomonas putida〕作为宿主，发酵周期短，只有几个小时，无需变性、复性过程，获得有活性产品。其纯化过程淘汰抗体亲和层析。表达产物无糖基化可溶性蛋白质，具有自然分子构造和生物活性， 上市产品有 IFN α-2b/安福隆。是目前较为成熟的生产工艺。下面介绍其工艺具体步骤：
基因工程假单胞杆菌的构建
干扰素基因的克隆(RT-PCR)
制备白细胞，病毒诱导，分别 mRNA,反录酶合成 cDNA,PCR。
基因连接质粒, 转化 ,筛选鉴定克隆。
测序。测序结果如下图。编码人 IFNα-2b 基因序列,501bp，165aa。
表达载体构建
IFN 基因与表达载体连接
3
转化大肠杆菌
筛选阳性克隆
获得序列正确表达载体
工程菌构建
转化假单胞杆
筛选高表达、稳定遗传的工程菌
获得原始菌种
.干扰素 α-2b 的发酵工艺过程工艺流程图如下图
摇瓶培育
〔1〕取保存工作种子批菌种，室温溶化。
〔2〕摇瓶培育：30℃，，250 r/min，18±2h。
〔3〕检测：OD 值和发酵液杂菌检查。
种子罐培育
〔1〕接种：接入 50L 种子罐，接种量 10%。
〔2〕培育：30℃，。
3
10
掌握：级联调整通气量和搅拌转速。DO 为 30%，3～4h，OD>。
检测：显微镜和 LB 培育基划线检查，掌握杂菌。
发酵罐培育
接种：通入 300L 培育基的发酵罐，接种量 10%。
掌握：级联调整通气量和搅拌转速。
〔3〕前 4h：30℃，，DO 为 30%。
〔4〕4h 后：20℃，，DO 为 60%，5～。
终点掌握：OD 值达 ±，5℃冷却水快速降温至 15℃以下。
检测：发酵液杂菌检查。
菌体收集
连续流离心机：冷却的发酵液，16000 r/min 离心收集。
菌体保存：－20℃冰柜，不超过 12 个月。
检测：干扰素含量、菌体蛋白含量、菌体枯燥失重、质粒构造全都性、质粒稳定性。
干扰素的分别纯化工艺过程
干扰素 α-2b 分别工艺过程
菌体裂解
裂解缓冲液：纯化水配制，2℃～10℃〔〕。
使用保护剂：EDTA，PMSF。
裂开－20℃菌体：2 厘米以下的碎块
搅拌：加裂解缓冲液，2℃～10℃，2hr。
冻融: 细胞完全裂开，释放干扰素。
预处理-沉淀
加絮凝剂聚乙烯亚胺:2℃～10℃，搅拌 45min，对菌体碎片进展絮凝。
加分散剂醋酸钙溶液:2℃～10℃,搅拌 15min，对菌体碎片、DNA 等进展沉淀。
离心
〔1〕连续流离心机：2℃～10℃，16000 r/min
收集上清液：含有重组干扰素蛋白质
杂质沉淀：121℃、30min 蒸汽灭菌,燃烧处理。
初级分别
盐析: 4M 硫酸铵，2℃～10℃，搅匀,静置过夜。
离心：连续流离心机，16000 r/min
保存：收集沉淀，粗干扰素，4℃保存。
干扰素纯化工艺过程
溶解粗干扰素
配制纯化缓冲液：
超纯水， 磷酸缓冲液， μm滤器和 10 ku 超滤系统，百级层流下收集。冷却至 2℃～10℃。
检查缓冲液的 pH 值和电导值。
溶解。 2℃～10℃，匀浆，完全溶解。
沉淀与疏水层析
等电点沉淀〔一〕：磷酸调整至 ，沉淀杂蛋白，离心收集上清液。
疏水层析：干扰素吸附在疏水层析柱中，除去非疏水性蛋白。
洗脱与收集： 磷酸缓冲液〔〕。
等电点沉淀〔二〕：磷酸调整 ，调整电导值 40 ms/cm，2℃～10℃， 静置过夜。
超滤：1000 ku 超滤膜过滤，除去大蛋白。
透析除盐：调整溶液 pH ，电导值，10 ku 超滤膜， M 缓冲液。
阴离子交换层析与浓缩
〔1〕 磷酸缓冲液〔〕平衡树脂。
盐浓度线性梯度 5～50 ms/cm 进展洗脱，
协作 SDS- 收集干扰素峰。
浓缩：调整溶液和电导，10 ku 超滤膜， 醋酸缓冲液〔〕中透析。
阳离子交换层析与浓缩
用 醋酸缓冲液〔pH 〕平衡树脂。
上样，一样缓冲液冲洗。
10
盐浓度线性梯度 5～50 ms/cm 进展洗脱
协作 SDS- 收集干扰素峰。
浓缩：10 ku 超滤膜进展。
凝胶过滤层析。
洗涤液： M NaCl 的 磷酸缓冲液〔〕清洗系统和树脂。
上样，一样缓冲液进展洗脱。
合并干扰素局部。
无菌过滤分装
〔1〕 μm 滤膜过滤干扰素溶液。
分装。
－20℃以下的冰箱中保存。
检测工程
干扰素鉴别试验。
干扰素效价测定。
蛋白质含量，纯度测定，分子量。
宿主剩余蛋白、剩余 DNA。
干扰素构造鉴定：紫外光谱，肽谱，N 端序列。
其他：热原，内毒素，残留抗生素。
我国基因工程制药产业进展状况
我国基因工程制药产业起步于 80 年月末，虽然起步较晚，但进展速度很快。
目前我国基因工程制药产业已进入快速进展时期。
1989 年我国批准了第一个在我国生产的基因工程药物——重组人干扰素
α1b，标志着我国生产的基因工程药物实现了零的突破。1998 年我国基因工程制
药产业销售额已到达了 亿元。 截止 1998 年底，我国已批准上市的基因工程
药物和疫苗产品共计 15 种。近年来我国基因工程制药产业进展迅猛，年销售额
已从 1996 年的 亿元增长到 1998 年的 亿元，年均增长率高达 80％。估量
2025 年我国基因工程药物销售将到达 亿元。
10
我国生物技术产业，特别是生物制药产业规模与美国相比差距很大。基因工程药物上市时间较美国同品种上市时间晚 5～10 年。
然而，我国目前生物技术药物却始终苦于缺乏自主创的产品，绝大多数上
市药物为仿制药，创药物的开发始终未能翻开局面。主要表现在以下几个方面：
〔1〕同种产品生产厂家过多，造成市场恶性竞争， 严峻影响产业的安康进展。
后我国开头跟踪研制的。我重复是导致医药产
业重复生产的源头。
融资渠道单一、产业进展资金缺乏。成为基因工程制药产业进展的巨大障碍因素。
医药市场竞争无序，行业不正之风严峻。这种恶性竞争非但未能使消费者受益，反而使得国家、制药企业和宽阔消费者的利益受到极大的损害。
企业治理相对滞后，技术兼经营型人才匮乏。企业的全部权与经营权不分的状况，既不利于企业的长远进展，也不利于企业经营阶层即企业家阶层的形成。
为此，要制定产业进展战略规划，强化财政税收优待政策，大力加强基因工程创药物的研制和生产。为从根本上转变我国基因工程制药业重复生产和缺乏国际竞争力的局面，我国的药研制开发思路必需做出战略调整，从以仿制为主向创与仿制相结合转变。可以有选择地合法仿制一些专利马上过期、疗效明确、应用前景宽阔的基因工程药物。对仿制药物有关的专利要进展认真的争论， 实行有效的专利回避策略，避开简洁的、盲目的仿制。要在仿制的根底上创。制造出与专利方法不同的生产工艺和方法，以避开引起专利纠纷。[5]
干扰素制品国内市场的现状与进展分析
需求量及其增长分析
自 1957 年觉察干扰素以来，40 年来的争论使人们对干扰素的生疏已有了根本改观，干扰素不仅是病毒间干扰现象的介质，而且是调整细胞功能的重要系统， 现在已进展成为与病毒学、细胞学、免疫学、临床医学、分子生物学以及肿瘤学有关的一个兴的争论领域，随着生物工程技术的兴起，目前已广泛进入临床应用时代。
2025 年-2025 年我国干扰素需求量统计
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单位：千克
25
20
15
10
5
0
需求量增长率
2025年

——
2025年

%
2025年

%
2025年

%
14%
12%
10%
8%
6%
4%
2%
0%
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需求地域构造分析
我国干扰素区域市场需求分析
数据来源：中国市场调查争论中心
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东北
%
华北
%
西南
%
华东
%
西北
%
中南
%
10
产品构造分析
数据来源：中国市场调查争论中心
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干扰素按制作方法不同，可分为利用基因工程生产的重组 α-干扰素和人自然干扰素两大类。从我国市场研发状况来看，目前重组 α-干扰素占据的市场比重较大，约为 %。
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