感受态细胞的制备和质粒的转化实验.docx

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学
院：
生命科学学院
专
业：
10 级生物工程
班
级：
三班
姓
学
名：
号：
林冬
指导教师： 肖露教师
感受态细胞的制备和质粒的转化试验
一． 试验目的：
把握用 CaCl2 法制备感受态细胞的原理和方法。
学习和把握质粒 DNA 的转化和重组质粒的筛选方法。二． 试验原理：
细菌吸取外源 DNA 的力量最高时的状态被称为感受态细胞。有些种类的细菌在其生长的任一阶段都处于感受 态，而另一些细菌只有处于某个生长时期时〔一般为对 数生长早、中期〕，才会处于感受态，如本试验所用的大肠杆菌。用肯定浓度的 CaCl2 处理对数生长早中期的细菌可以大大提高细菌吸取四周环境中的 DNA 分子的力量。对这种现象的一种解释是 CaCl2 能使细菌细胞壁的通透性增加，从而提高转化率。这种转化方法称为“化 学法”。
三． 材料：设备与试剂四． 试验方法：
① 取 100mlDH5ɑ培育物置于冰浴中 10min，同时将 Cacl2 和灭菌的 50ml 离心管 4℃中放置 10min.
② 在无菌条件下将培育物移入 50ml 离心管中〔不能超过2/3 体积约 30ml〕平衡后对称放入离心机，在 4℃，6000转/min,离心 5min,停顿离心后，弃上清液〔在超净工作上无菌条件下操作〕
③ 参加 5ml 预冷的 溶液，用涡旋振荡器振荡均匀使 DH5ɑ细胞重悬浮，置于冰水浴中旋转 20min 后，在 4℃6000 转/min 离心 5min,弃上清。
④ 细胞重复③一次，离心后弃上清，沉淀后用 4mlCacl2 悬浮，加灭菌甘油至浓度 15％左右， 管中，200ul/管，于 80℃冰箱中冻存备用。
转化试验：
200ul 感受态→参加 1ul 质粒混匀→42℃水浴 90s→快速拿出置于冰浴 2min→参加 800ulLB 培育基→ 37℃， 220rpm 振荡培育 1h→取出 100ul 涂板。
单菌落扩大培育
用接种环挑单菌落接入含 150ml 液体 LB 培育基锥形瓶中。37℃，120rpm 摇瓶培育，直至透过菌悬液看报纸上的字能够看出外形但不能识别。
碱裂解质粒及载体的提取
先取 菌液于 EP 管，然后再 1200 转离心，弃上清， 取 菌于 EP 管中〔重复 2 次〕共取 菌液沉淀， 收集于 EP 管中，→150ul(溶液 I[SET]悬→1200r/min 离心 1min→弃上清，浮沉淀重用。150ulSET 悬浮〔可用涡旋振荡器冰水浴上放 5min→加 350ul 溶液 II，巅倒 EP 管 30 次〔动作要轻〕→冰水浴放 5min→加溶液III300ul, 轻混 匀〔 同 上〕 → 冰水 浴放 5min →
12025r/min 离心 8min→上清移入的 EP 管中→参加
v 的异丙醇〔500ul〕→室温静置 15min→12025r/min离心 8min→弃上清液，沉淀用 75％乙醇〔500ul〕混匀
〔巅倒 30 次〕→12025r/min 离心→弃上清→重用75％乙醇处理一次→翻开 EP 管盖放入 50℃烘箱，枯燥DNA→无酒精味，放入 TE40ul 溶解DNA。
PGEM218 质粒与 PET32a 质粒载体的酶切及片段回收
单双酶切反响体系
〔一〕双酶切体系 30ul
PEGM218〔PET32a〕 23ul
EcoRⅠ
XhoI
10×Tango buffer 6ul (二)单酶切反响体系 30ul
PEGM218〔PET32a〕 23ul
EcoRⅠ
10×Tango buffer 2ul
H2O
37℃水浴大于 3h(3~4h)
琼脂糖电泳：6ul 酶切反响液+2ul 溴芬兰，6ulMAC+2ul 溴芬兰比照。电泳 30min,EB 染色 15min,观看。
中间为 MAC,左边两条为 PEGM218,右边 PET32
单双酶切都消灭两条 DNA 条带，且对应条带大小全都，说明质粒都能够被切开，可以进展下一步试验。
试验步骤：
〔一〕大量酶切：
酶切体系 60ul PGEM218〔PET32a〕46uL FCRI 1uL
XhoI 1ul
10×Tango buffer 12ul 37℃水浴大于 3h(3~4h)
PGEM218 与PET32a 各做两个体系。(二)琼脂糖电泳：
上样体积 60ul，MAC 比照。
左边六条带是PEGM218 酶切结果，中间四条是PET32 酶切结果，右边是MAC
(三)割胶回收
将电泳完的胶放在紫外灯下，开启紫外灯，将胶上目的 DNA 片段放入称过重量的 EP 管中，每管中的胶块小于 克〔400ul〕
向胶块中参加 3 倍体系重量的溶胶液〔 克体系为 100ul〕50℃水浴 10min。
向吸附柱 CA2 中参加 400ml 平衡液静置 2min,将CA2 柱放入离心管中，12025r/min 离心 1min，弃平衡液。
将溶胶液移入CA2 柱中〔如溶胶液体体积大可分屡次参加，每次加满即可〕，在 37℃水浴中保温5min,12025r/min 离心 1min,弃去液体。
向 CA2 柱中参加 500ul 漂洗液,12025r/min 离心1min,弃洗液。
向吸附柱 CA2 中参加 500ul 漂洗液静置2min,12025r/m 离心 1min,弃洗液。
将 CA2 柱于 37℃培育箱中放置 10min.
CA2 柱放入的干净 EP 管中，参加 50ul 已经在水浴中预热的洗脱液， 于 55 ℃ 水浴中静置10min,12025r/min 离心 2min,收集DNA 溶液。
编号
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
EP 管重 g










总 重 g










溶胶液ul










重组表达载体的构建以及转化
连接反响体系 10ul
T4 DNA ligase 1ul T4 DNA ligase buffer 1ul PEGM218 基因片段 6ul
PET32a 片段 4ul 12℃连接过夜
转化试验：
200ul 感受态→参加 1ul 质粒混匀→42℃水浴 90s→快速拿出置于冰浴 2min→参加 800ulLB 培育基→ 37℃，
220rpm 振荡培育 1h→分别取出 10ul、20ul、40ul 涂板， 每组涂两个。培育待消灭单菌落，挑取单菌落平板划线培育。
快速裂解检测菌落
挑取平板上的菌落于 5ul 无菌水中打散→参加 25ul 2× crinking buffer→混匀→离心〔12025rpm,5min〕→上清液点样电泳，染色观看。
试验过程中现象与结果记录： 8min:
14min:
15min:
27min:
53min: