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革兰氏染色的一般步骤 : .

革兰氏染色的一般步骤


革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种鉴
别染色法，1884 年由丹麦医师 Gram 创立。未经
染色之细菌，由于其与周围环境折光率差别甚小，
故在显微镜下极难观察。染色后细菌与环境形成
鲜明对比，可以清楚地观察到细菌的形态、排列
及某些结构特征，而用以分类鉴定。
革兰氏染色属复染法，即将标本固定后，先
用结晶紫染色 1 分钟后水洗，然后加革兰碘液媒
染一分钟后用酒精脱色，再用稀释石炭酸复红复
染。染色后除可以看到细菌形态外，还可将细菌
分为两大类，即不被酒精脱色而保留紫色者为革
兰氏阳性菌（G＋）。被酒精脱色复染成红色者为
革兰氏阴性菌（Gˉ ）。
革兰氏染色原理尚不肯定，可能与细菌所带
核糖核酸、细菌壁结构通透性、等电点等因素有
关。致病菌如金黄色葡萄球菌、绿色溶血性链球
菌、肺炎球菌、白喉杆菌、炭疽杆菌等属革兰氏
染色阳性菌。百日咳杆菌、大肠杆菌（大肠埃希
菌）、铜绿假单胞菌、伤寒杆菌、痢疾杆菌、霍
乱弧菌、沙门菌、流行性脑膜炎双球菌、淋病双 : .

球菌等均属革兰氏阴性菌。所以根据细菌的革兰
氏染色性质，可以缩小鉴定范围，有利于进一步
分离鉴定，以对疾病做出诊断。又由于各种抗生
素的抗菌谱不同，革兰氏染色尚可做为选用抗生
素的参考。

革兰氏染色法一般包括初染、媒染、脱色、
复染等四个步骤，具体操作方法是：
1）涂片固定。
2）草酸铵结晶紫染 1 分钟。
3）纯化水冲洗。
4）加碘液覆盖涂面染 1 分钟。
5）水洗，用吸水纸吸去水分。
6）加 95%酒精数滴，并轻轻摇动进行脱色，30
秒后水洗，吸去水分。
7）番红染色液（稀）染 10 秒钟后，纯化水冲洗。
干燥，镜检。




染色的结果，革兰氏正反应菌体都呈紫色，负反应菌体都呈红色。





: .








实验三 细菌的革兰氏染色法

一、目的要求
了解革兰氏染色的原理，学习并掌握革兰
氏染色的方法。
二、基本原理
革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要
性状。它是 1884 年由丹麦医师 Gram 创立的。革
兰氏染色法（Gram stain）不仅能观察到细菌的
形态而且还可将所有细菌区分为两大类：染色反
应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用 G+表示；
染色反应呈红色（复染颜色）的称为革兰氏 阴性
细菌，用 G-表示。细菌对于革兰氏染色的不同反
应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成
的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由肽聚糖形
成的网状结构组成的，在染色过程中，当用乙醇
处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，
通透性降低，使结晶紫-碘复合物被保留在细胞内
而不易脱色，因此，呈现蓝紫色；革兰氏阴性细
菌的细胞壁中肽聚糖含量低，而脂类物质含量高， : .

当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透
性增加，使结晶紫 -碘复合物易被乙醇抽出而脱
色，然后又被染上了复染液（番红）的颜色，因
此呈现红色。
革兰氏染色需用四种不同的溶液：碱性染
料（basic dye）初染液；媒染剂（mordant）；脱
色 剂 （ decoorising agent ） 和 复 染 液
（counterstain）。
碱性染料初染液的作用象在细菌的单染色
法基本原理中所述的那样，而用于革兰氏染色的
初染液一般是结晶紫（crysta vioet）。媒染剂的作
用是增加染料和细胞之间的亲和性或附着力，即
以某种方式帮助染料固定在细胞上，使不易脱落，
碘（iodine）是常用的媒染剂。脱色剂是将被染色
的细胞进行脱色，不同类型的细胞脱色反应不同，
有的能被脱色，有的则不能，脱色剂常用 95％的
酒精（ethano）。复染液也是一种碱性染料，其颜
色不同于初染液，复染的目的是使被脱色的细胞
染上不同于初染液的颜色，而未被脱色的细胞仍
然保持初染的颜色，从而将细胞区分成 G+和 G-
两大类群，常用的复染液是番红。
三、器材
大肠杆菌，金黄色葡萄球菌； : .

草酸铵结晶紫，番红水溶液，碘液， 95%
乙醇，载玻片，显微镜等。
四、操作步骤
1．涂片
将培养 24 小时的金黄色葡萄球菌和大肠
杆菌分别作涂片（注意涂片切不可过于浓厚），自
然干燥、固定。固定时通过火焰 1～2 次即可，不
可过热，以载玻片不烫手为宜。
2．染色
（1）初染：滴加结晶紫（以刚好将菌膜覆
盖为宜）一滴，染色 1-2min，倾斜后缓慢冲洗，
用吸水纸吸干。
（2）媒染：滴加碘液冲去残水，并覆盖约
一分钟，倾斜后缓慢冲洗，吸水纸吸干。
（3）脱色：将载玻片上面的水甩净，并衬
以白背景，倾斜玻片，用 95％酒精滴洗至流出酒
精刚刚不出现紫色时为止，约 20～30 秒钟，立即
用水冲净酒精。
（4）复染：用番红液染1～2 分钟，水洗。
（5）镜检：自然干燥后，置油镜观察。革
兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。以分
散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过于密集的
细菌，常常呈假阳性。 : .

（6）同法在一载玻片上以大肠杆菌与金黄
色葡萄球菌混合制片，作革兰氏染色对比。
注意：革兰氏染色的关键在于严格掌握酒
精脱色程度，如脱色过度，则阳性菌可被误染为
阴性菌；而脱色不够时，阴性菌可被误染为阳性
菌。此外，菌龄也影响染色结果，如阳性菌培养
时间过长，或已死亡及部分菌自行溶解了，都常
呈阴性反应。
五、实验结果与讨论


微生物染色液的配制

一、吕氏(Loeffler)碱性美蓝染液
A 液：美蓝(methylene blue) 0．6g
95%酒精 30ml
B 液：KOH 0．01g
蒸馏水 100ml
分别配制 A 液和 B 液，配好后混合即可。

二、齐氏(Ziehl)石炭酸复红染色液
A 液：碱性复红(basic fuchsin) 0．3g
95%酒精 10ml : .

B 液：石炭酸 5．0g
蒸馏水 95ml
将碱性复红在研钵中研磨后，逐渐加入 95%
酒精，继续研磨使其溶解，配成 A 液。
将石炭酸溶解于水中，配成 B 液。
混合 A 液及 B 液即成。通常可将此混合液稀
释 5—10 倍使用，稀释液易变质失效，一次不宜
多配。

三、革兰氏(Gram)染色液
1．草酸铵结晶紫染液
A 液：结晶紫(crystal violet) 2g
95%酒精 20ml
B 液：草酸铵(ammonium oxalate) 0．8g
蒸馏水 80ml
混合 A、B 二液，静置 48 小时后使用。

2．卢戈氏(Lugol)碘液
碘片 1．0g
碘化钾 2．0g
蒸馏水 300ml
先将碘化钾溶解在少量水中，再将碘片溶解
在碘化钾溶液中，待碘全溶后，加足水分即成。 : .


3．95%的酒精溶液(脱色用)。

4．番红复染液
番红(safranine O) 2．5g
95%酒精 100ml
取上述配好的番红酒精溶液 10ml 与 80ml 蒸
馏水混匀即成。

四、芽孢染色液
1．孔雀绿染液
孔雀绿(malachite green) 5g
蒸馏水 100ml

2．番红水溶液
番红 0．5g
蒸馏水 100ml

3．苯酚品红溶液
碱性品红 11g
无水酒精 100ml