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摘要
实时荧光定量PCR技术（Rt-qPCR）是一种常用于分子生物学实验室的分析方法，以其高灵敏度和高特异性而广泛应用于病毒感染病例的检测，作为一种有效的病毒病原体检测方法已得到广泛认可。而非特异性扩增则是Rt-qPCR技术研究中的常见问题，本文主要探讨Rt-qPCR中非特异性扩增的原因和影响及其控制方法。
正文
一. 研究背景
随着病毒感染病例的增多，研究病毒的检测方法变得越来越重要。实时荧光定量PCR技术(Rt-qPCR)由于其诊断简便、快速、灵敏且检测结果准确，已经成为病毒检测的重要手段。然而，Rt-qPCR中常出现非特异性扩增的问题。当扩增产物中成倍的增长严重影响检测准确性时，这个问题就必须得到重视。因此，如何控制非特异性扩增并提高Rt-qPCR的特异性是很有必要的。
二. 非特异性扩增的原因和影响
原因
非特异性扩增指PCR过程中与目标DNA不同的DNA序列被扩增，因此在PCR结果中扩增物的特异性降低。非特异性扩增的原因可能是由于以下因素引起的：
（1）引物或探针的选择不当，导致了不特异性的结合；
（2）一些高度同源性的序列（如人体内不同基因的家族成员），从而引起PCR过程中交叉互反；
（3）由于模板DNA的高度复杂性，不同片段的模板可以和引物或探针发生相互配对并被扩增；
（4）PCR反应体系组成与反应条件不当，如PCR反应缓冲液组成、Mg2+离子浓度、温度、循环次数等；
（5）环境污染等。
影响
非特异性扩增不仅会降低PCR的特异性，还会导致以下问题：（1）使PCR结果不可信；（2）影响实验的重复性和可重复性；（3）浪费贵重的反应试剂和样本；（4）增加实验成本并浪费时间，从而影响实验效率；（5）可能导致误报结果。因此，控制非特异性扩增影响实验结果的准确性和可靠性是至关重要的。
三. 控制非特异性扩增的方法
引物和探针的设计
在PCR实验中, 引物 与 荧光标记的探针 有很大的作用。误差或非特异性扩增的解决方案之一就是更合理的引物或探针设计。因此，正确选择引物或探针是避免错误扩增的第一步。对于一些较复杂的基因或者样本，可以先进行多序列比对来判断同源性。
PCR反应体系中Mg2+离子浓度和PCR反应循环次数的优化
一些基因或者样品的 PCR 可能需要改变环境条件以获得特殊的准确性和特异性。因此，在反应过程中调整环境条件以优化PCR反应至关重要。例如，PCR反应中Mg2+离子的浓度对PCR的特异性有很大影响；同时需要合适的循环次数保证PCR反应过程中有足够的扩增机会，但是不能循环过多，否则也会导致误扩增。
优化PCR反应体系中的多聚酶酶
多聚酶是PCR反应的核心部件之一，因此优化PCR反应体系中的多聚酶也可以有效地控制非特异性扩增。可以根据不同的基因或者样品选择不同种类的多聚酶。在与选择适当的引物、荧光标记探针配合使用时，可以有效控制非特异性扩增。
实验室防污染
实验室中的环境一定要保持清洁，对各个实验操作台面、仪器、耗材、实验员等要注意防污染。如果实验室太陈旧、不干净，则非特异性扩增的风险随之升高。同时，分析时要避免不必要的重复或重复使用试剂或试管，要保持卫生，确保样品不受外部污染。
四. 结论
实时荧光定量PCR技术已经成为病毒检测的重要手段，但非特异性扩增会严重影响其准确性，因此在实验操作过程中，应注意选择合适的引物探针、优化PCR反应体系等措施，保持清洁环境，从而达到更高的特异性以及更准确的检测结果。
参考文献
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