包涵体蛋白质复性-纯化.ppt

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01
Market Proportion by Host Cells
(biopharmaceutical proteins or ”Pharmateins”)
Yeast: 28%
E. coli: 54%
Animal cell: 21%
E. coli inclusion body route
occupies
about a half
包涵体：在某些生长条件下，基因工程菌能积累某种特殊的生物大分子，它们致密地集聚在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露结构，这种水不溶性的结构称为包涵体（Inclusion Bodies，IB）。
包涵体的组成及特性
一般含有50%以上的重组蛋白，其余为核糖体元件、RNA聚合酶、外膜蛋白等，环状或缺口的质粒DNA，以及脂体、脂多糖等，-1um，难溶与水，只溶于变性剂如尿素、盐酸胍等。
包涵体与蛋白种类及表达系统无关，仅为蛋白过量表达的结果。
包涵体的形成
在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子，或环境不适，无法形成正确的次级键等原因形成的。
最大缺点：一级结构正确，高级结构错误。
包涵体形成的主要原因
表达量过高。原因可能是合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能完全正确的配对，过多的蛋白间的非特异性结合，蛋白质无法达到足够的溶解度等。
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重组蛋白的氨基酸组成：一般说含硫氨基酸越多越易形成包涵体
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重组蛋白所处的环境：发酵温度高（37-42℃）或胞内pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵体。
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重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白，由于缺乏真核生物中翻译后修饰所需酶类，致使中间体大量积累，容易形成包涵体沉淀。采用共表达分子伴侣的方法以增加可溶蛋白的比例。
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包涵体表达的有利因素
Advantages:
前的纯化步骤，不用考虑蛋白质的失活问题。
，细胞破碎和以后复性
04
就可以与可溶性蛋白分离，有利于分离纯化。
，且只需要简单的低速离心
03
有时甚至可以达到细胞总蛋白含量的30%
，有利于表达量的提高。
02
表达可以避免蛋白酶对外源蛋白的降解。
，包涵体
01
包涵体表达的不利因素
Disadvantages:
01
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。
02
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03
瓶颈
，经常成为放大的
分离纯化细菌包涵体蛋白质的基本步骤：
破碎细胞
(Disruption of cell)
↓
分离包涵体
(Seperation of inclusion body)
↓
溶解包涵体
(Dissolve inclusion body)
↓
蛋白质产物的构象复原等。
(Recovery of target protein conformation)
包涵体的复性前准备
洗涤：由于脂体及部分破碎的细胞膜及膜蛋白与包涵体粘连在一起，在溶解包涵体之前要先洗涤包涵体，通常用低浓度的变性剂如2M尿素在左右、1mMEDTA中洗涤。此外可以用温和去垢剂TritonX-100洗涤去除膜碎片和膜蛋白。