干货I细胞复苏、冻存、传代之实验操作及注意事项.docx

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一、 细胞培育前期预备工作
细胞培育仪器设备：
细胞培育通风橱〔即生物安全柜〕
培育箱〔通用推举：湿式二氧化碳培育箱〕
离心机
医用冰箱〔4℃〕和冰柜〔-20℃〕、生物超低温冰箱〔-80℃〕、液氮冷冻罐
倒置显微镜
其他用品：细胞培育容器〔培育瓶、培育皿、多孔板等〕，吸管和移液器，培育基、血清和试剂
留意事项:
无菌工作区域：细胞培育试验室的主要要求是需要维持细胞培育操作工作区域处于无菌状态，最简洁经济的方式就是使用细胞培育通风橱。
无菌试剂和培育基：商品化试剂和培育基经过严格的质量掌握以确保无菌， 留意操作过程中不要被污染，其他试剂和溶液需要选择适当的灭菌方法〔例如：高压蒸汽、无菌过滤等〕进展灭菌。
无菌操作：要求操作人员在试验开头前对工作区域和双手操作局部进展 75% 酒精消毒；尽量使用一次性塑料吸管进展单次操作，避开穿插污染；和培育用具使用时方可开盖，用后要第一时间盖上，暴露于环境中的时间尽可能要短。
整体的细胞试验环境也弥足重要，需要定期对试验室环境进展较为彻底的清
扫消毒和杀菌，包括试验用仪器和室内地面、桌面等。
二、 细胞的复苏与冻存
细胞复苏：
在细胞状态缺乏以满足试验需求或者消灭细胞污染的状况下，需要进展细胞复苏：
从超低温冰箱或者液氮中取出自保存或商品化购置的冻存细胞后，快速转移至 37℃水浴条件下轻轻转动溶化〔一分钟内〕。
75%酒精擦拭冻存管外部后，转移至通风橱中。
参加适量颖的完全培育基混合，约 800-1000rpm 下离心 5-10 分钟，实际离心速度时间取决于细胞种类和细胞状态。
颖培育基重悬后接种于相应的培育器皿中，做好标记，37℃，5%CO2 条件下培育。
细胞冻存：
为现有细胞系做细胞储藏，需要对代数相对靠前的细胞进展扩增培育和细胞冻存：
预备细胞冻存液，置于 2℃-8℃下备用。
观对待冻存的细胞，密度到达 80%-90%左右，将贴壁/悬浮细胞分别依据传代方法收集。
使用血球计数板对细胞密度进展大致估算后，计算出冻存溶液的体积，从而保证单支冻存细胞有足够的细胞量用于复苏。
约 800-1000rpm 下离心 5-10 分钟，无菌条件下留神弃去培育基，不要搅动细胞沉淀。
用适宜体积的预冷后冻存液重混悬细胞沉淀，分装至冻存管中，做好标记
后进展梯度降温至液氮环境中保存，入库。
*对于传统的细胞冻存，需要进展程序降温〔4℃→-20℃→-80℃→液氮〕冻存， 为避开操作流程的繁琐不行控，可选用无血清非程序降温细胞冻存液，包括Cellregen 无血清细胞冻存液和无血清低 DMSO 细胞冻存液。两种细胞冻存液均有无血清、无动物源蛋白、非程序降温的特点，可直接放置-80℃冰箱冻存。
通用细胞冻存液
Cellregen 无血清细胞冻存液无血清低 DMSO 细胞冻存液
主要成份
细胞毒性
含血清、含 DMSO
凹凸
不含血清，含 DMSO 10%
高高
不含血清，低 DMSO 5%
低高
安全性
动物来源病毒、霉菌和支 无动物来源病毒、霉菌和支原 无动物来源病毒、霉菌和支原
原体等污染的风险偏高
冻存细胞种
类
体等污染的风险
通用型
体等污染的风险
通用型
适合含血清细胞冻存
适合各类细胞冻存
适合各类细胞冻存
无血清培育
细胞生长状
易转变易由悬浮状态回复
贴壁状态
保持悬浮培育状态
保持悬浮培育状态
附：冻存液比照
态
批次差异
批次差异大
无批次差异
无批次差异
步骤繁琐
简洁快捷
简洁快捷
操作方法
需程序降温冻存
一步冻存 -80 ℃冰箱
一步冻存 -80 ℃冰箱
保存设备
要求高〔液氮〕
要求低〔 -80℃ 冰箱〕
要求低〔 -80℃ 冰箱〕
微量冻存
细胞易死亡，存活率偏低
细胞存活率高
细胞存活率高
可行，且便利快捷
可行，且便利快捷
原位冻存
不行行
如 : 杂交瘤细胞孔板冻存
如 : 杂交瘤细胞孔板冻存
留意事项：
细胞的复苏中，如细胞对温度比较敏感，可将生长培育基预热至 37℃后再参加溶化后的细胞冻存液中混匀。
将复苏的细胞高密度接种，如两支冻存细胞接种到一个孔板中，可有效提高
复苏效率。
细胞冻存，在参加冻存液进展分装的过程中，要不时轻轻混合细胞，使其保持均匀的细胞悬液状态，更有利于保证细胞的冻存效果。
三、 细胞传代
贴壁细胞传代流程：
当培育贴壁细胞密度到达 80%左右即可细胞的传代操作，从培育器皿中吸弃原有的细胞生长培育基。
使用不含钙镁离子的平衡盐溶液轻轻润洗细胞〔缓冲液用量依据培育器皿的外表积调整〕，避开搅动细胞，前后轻晃动器皿数次。
吸弃缓冲液，重复润洗一次。
向培育器皿中参加适量的预热解离剂〔如胰蛋白酶等〕，充分掩盖细胞层，轻轻晃动容器数次。
将培育器皿在室温下孵育 2-5 分钟。实际孵育时间实际依据细胞系的种类不同而定。
移至倒置显微镜下观看细胞解离状况，可轻轻拍打器皿壁沿以加快细胞解离。
当细胞解离程度大于 90%，参加三倍于解离液体积的生长培育基中止解离过程，轻轻晃动后吹打细胞，收集至无菌离心管中。
约 800-1000rpm 下离心 5-10min，实际离心速度时间取决于细胞种类和细胞状态。
弃去含解离剂的上清溶液，用最少体积的生长培育基重悬细胞沉淀，混匀后
取出少量使用血球计数板计算细胞数量。
将细胞悬液稀释到该细胞系推举的接种密度，并将适量体积的细胞悬液转移至的细胞培育器皿中放回培育箱。
悬浮细胞传代流程：
当细胞生长至适合传代〔即处于对数生长期而未到达聚合的状态〕时，从培育瓶中吸取出少量的细胞样品，如有细胞已局部沉淀，要先轻轻晃动培育瓶使细胞处于均匀的悬浮状态后再取样。
使用血球计数板对细胞进展计数。
计算将细胞稀释到推举接种密度所需要的参加的培育基体积，如有必要，可先对培育瓶中细胞进展离心收集〔800-1000rpm、5-10min〕后再重悬计数和接种。
在无菌状态下将适量预热的生长培育基参加培育瓶中，必要时可将培育的细胞分散接种到多个培育瓶中。
将培育瓶的旋盖外旋一圈，便于进展充分的气体交换〔或者使用透气性瓶盖〕，并将培育瓶放回培育箱中连续培育。
留意事项：
贴壁细胞在进展解离〔消化〕过程中，假设室温下效果不抱负，可转移至 37℃ 培育箱中加快该过程，但要留意掌握时间，每 30 秒需要镜检一次。
细胞在缓冲液润洗过程中要尽量完全彻底，培育液中的血清残留会影响消化效果。
为了削减细胞碎片和无用的代谢副产物在培育液中累积，每三周或者必要时
都应将悬浮细胞收集起来进展一次离心重悬再接种，具体操作等同于正常的传代培育。
通常状况下，悬浮细胞培育中所需添加特定的生长依靠因子，尽量依据“现用现添加”的原则，从而保证培育基中该物质的浓度足够满足细胞的生长需求。