大肠杆菌感受态细胞及其制备.ppt

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感受态的制备
细胞处于能够吸收外源DNA的状态称感受态，经特殊处理后处于此状态的细胞称感受体细胞。
作为感受态细胞应具备什么特点？
细胞表面暴露出一些可接受外来DNA的位点（以溶菌酶处理，可促使受体细胞的接受位点充分暴露）*。
细胞膜通透性增加（用钙离子处理，可使膜通透性增加，使DNA直接穿过质膜进入细胞）。
受体细胞的修饰酶活性最高，而限制酶活性最低，使转入的DNA分子不易被切除或破坏。
将构建好的载体转入感受态细胞进行表达(转化)，不仅可以检验重组载体是否构建成功，最主要的是感受态细胞作为重组载体的宿主可以进行后续实验，如蛋白质表达纯化等工作。
制备感受态的方法
电击法
化学方法
CaCl2 制备法
氯化锂制备法（毕氏酵母）
电击法与CaCl2 制备法的区别
原理：
电击法:利用瞬时高压电流（数千伏特）处理细胞悬浮液，使微生物细胞膜在高压电作用下发生去极化，产生微孔，悬液中溶解的核酸即可通过细胞膜上的空洞进入细胞内部。
CaCl2 法:利用低渗溶液处理细胞悬浮液微生物细胞膜结构发生变化，使得细胞在热激时（42℃，90s）变得很容易从溶液中摄取DNA。
其他：
做电击转化时，悬液中会有大部分细胞会因电击而死亡，但是这种方法很直接，转化效率很高。另外，需要专门的仪器。
化学转化法操作简单，不需要特殊设备，转化效率足以满足一般克隆实验的需要，故使用范围非常广。
下面详细介绍CaCl2制备法。
CaCl2制备法
原理
在CaCl2溶液中，细胞会发生膨胀，Ca2+会使细胞膜磷脂双分子层形成液晶结构，促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来，离开所在区域，诱导细胞成为感受态细胞。
仪器及设备
高速冷冻离心机、超净台、冰盒、冰若干等。
离心杯、移液器、吸嘴、EP管、自封袋等。
培养基及试剂
液体LB培养基、无抗平板、Amp平板、带Amp抗性的质粒、100mM CaCl2 溶液（含15%甘油）。
01
02
准备工作
1
所有使用的移液器、吸嘴、离心杯、EP管以及装培养基的容器最好是专用。
2
洗涤容器时用水清洗干净，尽量不要用洗涤剂（洗涤剂一般含有表面活性剂而表面活性剂对感受态影响很大）
3
离心杯、EP管灭菌后置于-20℃预冷备用。
4
自封袋写上感受态名称、批号。