不同马铃薯基因型对根际细菌群落结构的影响.docx

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颜 朗， 张义正, 方志荣, 清 源, 黄 莓, 赖先军
(， 四川马铃薯高等学校重点实验室， 西昌 615000; 四川省分子生物学及生物技术重点实验室， 成都 610064)
1 引 言
植物依赖其根系和土壤微生物之间有益的相互作用来促进其营养吸收，根际是土壤-植物生态系统物质交换的活跃界面，根际微生物对促进作物生长、减少病原微生物侵害以及维持根际微生态平衡等具有重要作用[1].根际微生物组被认为是植物的“第二基因组”，研究估算约有106～109cells/cm2的微生物群落定殖[2].特定的生态环境和植物类型条件下根际土壤中微生物群落结构差异使植物表现出特定的根际效应(Rhizosphere effect)，根际效应直接影响着根际微生物的营养选择和富集[3].在自然条件下，植物及多种生态因子复杂的多变
性，使得不同植物甚至是同一物种的不同基因型间对根际微生物群落结构也有着不同的影响[4].根际微生物组主要由植物体外部土壤中的微生物组合而成[5].根据植物根际和内生微生物组的组成，已有研究提出植物可以分为两步组装它们的微生物组，第一步是将根系附近微生物召集到根表面区域，第二步才是进入根内部，，但研究认为这是一个貌似有理的假设[6].然而，我们至今对植物和土壤之间的关键屏障，也就是根际微生物的群落结构及其定殖因素仍然知之甚少，并且大多数作物中根际微生物的组成以及影响因素也都是未知的.
高通量测序方法提供了根际微生物组的最新研究手段，最近越来越多的研究使用高通量测序来对不同植物(包括拟南芥、水稻和玉米)的细菌组提出了新的认识[7-9].通过测序产生高覆盖深度的16S rRNA基因的测序数据，用以估计细菌群落的物种构成及其丰度，能够更加真实的揭示原位环境中细菌群落的多样性和复杂性，这些研究为探索植物微生物组的组成和结构以及影响它们的因素开辟了新的途径[10].然而，这些研究仍处于初始阶段，迄今为止，不同基因型作物品种对根际微生物活性及群落组成的作用研究甚少并且几个关键问题尚未得到解决，如作物基因型影响根际微生物群落的主要机制尚未知晓，基因型对根际微生物的影响是否与根系分泌物有关等问题值得研究.
马铃薯是四川凉山州广大彝区世代相传的主食作物，，马铃薯逐渐遭遇幼苗生长发育不良、产量降低、畸形薯比例增高、，根际微生物种
群结构的失衡是导致土壤质量下降、，通过对不同马铃薯品种根际细菌16S rRNA基因的深度测序检测了超过250 000个操作分类单位(OTU)，旨在揭示不同马铃薯基因型对根际细菌定殖的影响，以进一步探究马铃薯地下部分与微生物的互作关系.
2 材料与方法
材 料
选取具有凉山特色的马铃薯高山地方种‘乌洋芋’、‘牛角洋芋’、西昌学院自育的高产品种‘西薯1号’、‘西薯3号’以及凉山州主栽品种‘青薯9号’和‘米拉’(图1A).
方 法
马铃薯盆栽试验及样品采集 (坐标： 583， 844)，试验时间为2018年3～，将基础土壤填装于口径34 cm的塑料盆钵中并以75 g/m2用量的有机肥作基肥施于10 ，用 1%次氯酸钠溶液消毒10 min，70%乙醇浸泡30 s后立刻除去乙醇，无菌水冲洗5次，.
播种前采用多点混合采样法对基础土壤和有机肥料进行取样，，每个马铃薯品种随机选取3盆作为一个生物学重复，把马铃薯植株从盆钵中整株挖出，不要伤害根系，抖落根系土壤表层未分解的凋落物层后用无菌刷刷取根际区域约1 mm的紧密粘附在根表面的土壤.
g左右的根际土壤并搜集至50 mL无菌离心管中，带回实验室过2 mm筛后分装至冻存管中，迅速置于液氮中冷冻 3～4 h，冰上备用或转移至-80 °C长期保存.
样品总DNA提取与测序 根际细菌DNA提取采用美国MOBIO公司的 Power Soil DNA Isolation Kit g 保存于-80 °C冰箱中的土壤样品，按试剂盒说明书过程提取总DNA，通过超微量分光光度计(Nanodrop 2000)检测DNA浓度≥20 ng/mL，OD260/～，OD260/～-20 °(5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3’)和806R(5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT)扩增细菌16S rRNA基因的V3-V4区域，并采用Illumina MiSeq 2×.
数据质控与分析 高通量测序得到的原始数据进行数据质控(Trimmomatic软件, version )和软件拼接(FLASH软件 , version )[11-12]，过滤掉低质量的Reads序列并将得到的双端序列数据拼接成一条序列Tags，同时对拼接效果进行质控，主要包括去除低质量Tags和去嵌合体(UCHIME软件, version )[13].将有效Tags按照相似性≥97%序列聚类成为单元(USEARCH软件,version )[14]，1个操作分类单元为1个OTU (Operational Taxonomic Units) ,%作为阈值过滤OTU[15].使用R/BioConductor包edgeR中trimmed mean of M values (TMM) 方法对OTU矩阵进行均一化[16].基于Silva(细菌)分类学数据库对OTU进行分类学注释(RDP Classifier软件，version ，)[17-18]，得到每个OTU对应的物种分类信息，进而在各水平统计各样品群落组成.
使用QIIME软件进行单样品组成Alpha 多样性分析，计算样品的 Coverage、Chao1、ACE、Simpson、Shannon 指数等[19].其中Chao1和ACE丰富度估计量度量了样本中的菌群丰度，，说明群落多样性越高，， 为R值，范围为- R 值越接近 1，()函数进行样本间主坐标分析(PCoA).PCoA分析基于由样本组成计算得到的距离矩阵进行特征向量降维排序，从均一化的OTU矩阵中计算加权和未加权的UniFrac距离矩阵，其中加权考虑物种的丰度，未加权则没有对物种丰度进行加权处理.
3 结果与分析
不同基因型样本根际细菌群落组成
共计采集样品36个，细菌16S rRNA基因测序共获得3 542 568对双端序列(Reads)，经Reads拼接过滤后得到3 097 269条高质量序列(Clean tags)，每个样本中Clean tags数在65 081～89 830之间；质控后的序列依据97%的序列相似性聚类获得细菌OTU数1 565个(不同样本和重复间取并集所得)，其中播种前的基础土样和肥料中OUT数据量分别在1 159～1 191之间和52～57之间，收获期不同品种马铃薯根际土壤中有效OTU数量在1 357～1 514个之间(图1B).>99%，认为该测序量能够反映样本中细菌群落的真实情况(表
1).将不同样本生物学重复间的OTU数据合并后进行细菌群落特异性分析显示，所有样本中共有OTU仅4个，而肥料中特异性OTU为26个，占肥料总OTU数的47%，，另在牛角洋芋发现10个特异性OTU，乌洋芋和西薯3号中发现8个，其余品种中各发现1个(图1C).若仅统计6个马铃薯品种中根际细菌群落特异性，则品种间共有OTU为1 000个，品种间OTU种类相差不大.
图1 不同基因型马铃薯根际细菌菌群组成
(A)不同马铃薯试验材料表型示意图；(B)不同样本根际细菌总OTU数量；(C) 不同样本间特异性根际细菌OTU数量；(D)不同样本根际细菌菌门相对丰度
Fig. 1 Rhizosphere bacterial composition among different potato genotypes
(A) Phenotypes of different potato materials. (B) Total number of OTUs in rhizosphere microbiome among different samples. (C) Specific OTUs in rhizosphere microbiome among different samples. (D) Relative abundances of bacterial phyla among different samples
图2 不同马铃薯基因型根际细菌群落物种分布热图
(A) Relative abundance of bacterial community at phyla-level among all samples. (B) Relative abundance of rhizosphere bacterial community at genus-level
经注释后的细菌种类相对丰度比例图显示(图1D)，品种间主要根际细菌群落种类趋于一致，群落丰度水平Top 5的菌门分别是变形菌门(Proteobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、芽单胞菌门
(Gemmatimonadetes).值得注意的是，肥料中占绝大多数的蓝藻(Cyanobacteria)在马铃薯收获期的根际细菌中丰度锐减，几乎无法存活，类似的情况还有厚壁菌门(Firmicutes).图2A显示了样品中的物种分布丰度的聚类情况，将高丰度和低丰度的细菌群落分块聚集，，基础土壤中的酸杆菌门(Acidobacteria)和Saccharibacteria特异性显著富集，，在收获期乌洋芋和牛角洋芋中分别发现衣原体门(Chlamydiae)和螺旋体门(Spirochaetae)，有389个OTU在基础土壤和肥料中均未富集，，这部分新出现的细菌种类呈现分块聚集，以芽球菌属(Blastococcus)为代表的5个分类群特异性富集在西薯1号和西薯3号；以芽单胞菌属(Gemmatimonas)为代表的2个分类群在青薯9号和米拉中丰度较高；而以鞘藻属(Microcoleus)为代表的6个分类群在地方品种乌洋芋和牛角洋芋中呈现高丰度(图2B).
不同基因型马铃薯根际细菌的群落多样性
为了分析在平行条件下根际细菌群落结构是否受到马铃薯基因型的影响，我们对收获期马铃薯根际细菌样本间OTU丰度的相关性进行了统计(图3)，以皮尔森相关性系数R判定两两样本间相关强度，结果表明，6个马铃薯品种根际细菌群落两两间都具有显著的正相关性，青薯9号(R=，P<-16)中的根际细菌丰度与基础土壤之间呈现显著正相关，而其他马铃薯品种与基础土壤之
间并无显著相关性，，所有马铃薯根际细菌和肥料细菌群落均无相关性.
Alpha(α)多样性能够反映样品内部物种丰度及物种多样性，
图3 Correlation analysis of rhizosphere microbiome between different potato genotypes
下，牛角洋芋根际细菌群落ACE指数和Chao1指数最低，表明其群落丰度最低；乌洋芋根际细菌群落中Shannon指数最低，，不同基因型马铃薯根际细菌群落组成丰富度从大到小排列为：米拉>青薯9号>西薯1号>西薯3号>牛角洋芋>，从群落物种组成的均匀度可以看出，，乌洋芋和其他品种的根际细菌群落间存在着显著的多样性差异(T检验：P=-3～-2；ANOVA：P=-3～-2).
表1样本Alpha多样性指数统计