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戚华文，徐 鑫，温 柔，高德嵩，王超然， 刘艳芳，金红利，梁鑫淼
(中国科学院大连化学物理研究所，辽宁 大连 116023)
的干燥幼果，具有破气消积，化痰散痞的功效，常用于积滞内停、痞满胀痛、泻痢后重、大便不通、痰滞气阻、胸痹、结胸、脏器下垂等症状[1]。枳实中含有黄酮苷类成分，主要为柚皮苷、新橙皮苷和橙皮苷等[2-4]。现在药理学研究表明，枳实具有促进肠胃蠕动、抗肿瘤、抗氧化和抗炎等药理活性[5-7]。枳实药材资源分布广泛，主产于江西、湖南、四川等地，以江枳实(江西清江)、湘枳实(湖南沅江)等为道地药材，并根据直径进行枳实等级划分，均以肉厚瓤小、质坚实、香气浓者为佳。由于枳实产地广泛且栽培品种繁多，市场上药材质量差异较大[8]，药典中枳实仅以辛弗林为含量测定及鉴别对象，并不能完全反映药材的品质，因此建立一种简单有效的分析方法对不同产地枳实进行质量评价显得尤为重要。
指纹图谱是鉴定中药真伪、评价其质量一致性和稳定性的可行性方法，通过光谱和色谱法获得中药的化学成分，具有信息量大、特征明显、完整性和模糊性等特点[9-10]。中药指纹图谱可以反映出各种化学成分分布的整体状态,从而更全面地对中药进行质量评价。本文采用高效液相色谱(HPLC)法对22批枳实药材的指纹图谱进行研究，并利用液相色谱-四极杆飞行时间质谱(HPLC-QTOF-MS)联用技术鉴定共有峰的化学结构，同时结合聚类分析(CA)、主成分分析(PCA)、正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)等化学计量学方法对其质量稳定性进行研究，并探讨枳实HPLC指纹图谱共有模式在易混淆品枳壳中的鉴别应用，为枳实质量评价提供了参考。
1 实验部分
仪器与试剂
表1 药材样品信息Table 1 Sample information of medicinal materials
高效液相色谱系统，包括2695梯度泵，2998二极管阵列检测器，自动进样器，柱恒温系统，Empower色谱工作站(美(梅特勒-托利多有限公司)；超高效液相色谱系统(日本岛津公司)，AB SCIEX X500系列QTOF质谱仪(美国AB SCIEX 公司)。Tnature-ACCHROM C18色谱柱( mm×250 mm,5 μm,美国沃特世公司)、Symmetry C18色谱柱( mm×250 mm,5 μm,美国沃特世公司)、Eclipse XDB-C18色谱柱( mm×250 mm,5 μm,美国安捷伦公司)。
新橙皮苷(批号B21390，规格20 mg，%)购自上海源叶生物科技有限公司。药材：枳实药材S1～S22共22批，采自江西刘公庙、湖南、福建等地；枳壳药材Z1～Z5共5批，采自江西刘公庙，各批次药材质量符合2020年版
《中国药典》，经中鉴定，均为正品，具体信息见表1。乙腈、甲醇(4 L，色谱级，Sigma-Aldrich)；甲酸(500 mL，色谱级,Aladdin)。实验室用水来自Milli-Q超纯水净化系统(Billerica,MA,USA)。
实验条件
HPLC-DAD色谱条件色谱柱：Tnature-ACCHROM C18柱( mm×250 mm,5 μm)，流动相为乙腈(A)-%甲酸溶液(B)，程序洗脱：0～10 min,5%～18%A；10～35 min,18%～27%A；35～40 min,27%～48%A；40～60 min,48%～95%A；60～65 min,95%A； mL/min；进样量为10 μL；柱温为30 ℃；检测波长为320 nm。
HPLC-QTOF-MS质谱条件液相条件与上述相同。离子源：ESI 离子源；正离子模式；气帘气： kPa；Gas 1： kPa；Gas 2： kPa；温度：550 ℃；离子化压力：5 500 V，去簇电压：80 V；全扫描范围：m/z50～1 500；裂解电压：40 V;CE Spread：20 V。
溶液的制备
对照品溶液的制备取新橙皮苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含新橙皮苷80 μg的对照品溶液。
供试品溶液的制备取枳实药材粉末(过三号筛) g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，称定重量，超声处理(功率500 W，频率40 kHz) 30 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
2 结果与讨论
方法学考察
精密度取批号为S1的枳实药材，制备供试品溶液，连续进样6次，记录特征图谱。各特征峰的相对保留时间的相对标准偏差(RSD)均小于1%，主要特征峰的相对峰面积的RSD均小于5%，表明仪器的精密度良好。
稳定性取批号为S1的枳实药材，制备供试品溶液，分别于0、6、12、18、24 h注入液相色谱仪，记录特征图谱。各特征峰的相对保留时间的RSD均小于1%，主要特征峰的相对峰面积的RSD小于5%，表明供试品溶液在24 h内的稳定性良好。
重复性取批号为S1的枳实药材，制备6份供试品溶液，进样，记录特征图谱。各特征峰的相对保留时间的RSD均小于1%，主要特征峰的相对峰面积的RSD小于5%，表明该方法的重复性良好。
耐用性试验
色谱柱的影响取批号为S1的枳实药材，制备供试品溶液，在相同色谱条件下，考察了规格均为250 mm× mm .，5 μm的Symmetry C18、Eclipse XDB-C18和Tnature C183根C18色谱柱对枳实特征图谱的影响。结果显示，在3根C18色谱柱上，枳实特征图谱的色谱峰数目和分离度均无明显差异。实验最终选用Tnature C18色谱柱。
柱温的影响取批号为S1的枳实药材，制备供试品溶液，考察20、25、30、35、40 ℃等不同柱温对枳实特征图谱的影响。结果显示，5种柱温条件下
特征图谱的分离效果无明显差异，各色谱峰的峰形和分离度均较好。表明不同柱温对枳实药材特征图谱的影响较小，最终选择柱温为30 ℃。
不同流速的影响取批号为S1的枳实药材，制备供试品溶液，、、、、 mL/min等不同流速对枳实特征图谱的影响。结果显示，不同流速条件下，枳实特征图谱的分离效果差异不大， mL/min。
枳实指纹图谱的建立
取22批(S1～S22)枳实药材，按“”制备枳实供试品溶液,按“”依次进样检测，采集22批枳实的HPLC指纹图谱(图1)。将S1～S22批枳实样品的色谱图全部导入《中药色谱特征图谱相似度评价系统软件》(2012版)，以S1批药材的图谱为校正参照，使用中位数进行自动匹配，加以多点校正，可识别12个共有色谱峰，得到枳实药材的对照谱图(图2A)，选择出峰时间稳定且相对居中的新橙皮苷峰作为参比峰。根据色谱峰匹配结果进行相似度分析，得S1～、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、。相似度结果显示，，无法区分不同产区的枳实药材。
指纹图谱共有峰的指认
为明确枳实的物质基础组成，本实验采用HPLC-QTOF-MS对枳实中的化学成分进行较全面的定性分析，从而提高其质量控制水平。取批号为S1的枳实药材，制
备供试品溶液，按“”的HPLC-QTOF-MS质谱条件进行质谱数据采集，通过比对精确相对分子质量和特征碎片离子，结合软件推断的分子式及文献报道，鉴定出枳实11个共有峰，结果见表2。
聚类分析(CA)
以22批枳实指纹图谱中12个共有峰峰面积为变量，导入SPSS ，采用组间均连法，选择平方欧式距离为测度对其进行系统聚类分析。根据CA结果(图3)，22批枳实样品分为2类，其中来自江西产区的样品S1～S12聚为一类，来自福建和湖南产区的样品S13～S22聚为一类，表明福建与湖南产区的枳实指纹图谱相似度较高。对3省产区的枳实性状进行比较，结果表明，江西的枳实皮较厚、瓤囊较小，而湖南和福建两个产区的枳实性状相近，但与江西产区枳实的性状差异显著。因此，聚类分析结果与性状鉴别结果一致。
图1 HPLC fingerprints of 22 batches of Citrus aurantium
表2 枳实特征峰的鉴定Table 2 Identification of characteristic peaks of Citrus aurantium
图3 22批枳实药材的聚类分析树状图
Cluster analysis dendrogram of 22 batches ofCitrusaurantium
图4 PCA scores of Citrus aurantium samples
图5 枳实药材样品的OPLS- OPLS-DA scores of Citrus aurantium samples
图6 枳实样品的变量载荷评价参数(VIP) Variable load evaluation parameter(VIP) value of Citrus aurantium samples
主成分分析(PCA)
PCA是采用线性投影将原来的多个变量空间转化成一组新的正交变量的统计分析方法，可实现高维数据的降维处理，少数几个主成分即可代表原始数据的大部分信息[11]。本实验采用SIMICA ，以22批次枳实样品的共有峰峰面积为数据阵，对不同产区枳实药材进行主成分分析。根据得分图(图4)可以看出，江西产区枳实聚为一类，福建和湖南产区聚为一类，不同产区的枳实样品存在差异性，与聚类分析结果一致。由图4还可以看出，产区为湖南的样品S23离散度较大，说明同一产区样品的内部差异性较大；而江西产区样品分布较为集中，差异性较小。
正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)