李恒 谭金燕 周鲜娇 Summary：为了优化桑叶黄酮提取工艺，探讨其抗氧化活性，以微波功率、微波时间、乙醇浓度、液料比和提取次数为影响因素，以桑叶黄酮提取率为考察指标，采用单因素和Box-Behnken 法优化提取工艺，并通过测定桑叶黄酮提取物对DPPH·、·OH和O2-·自由基的清除能力，探讨其体外抗氧化活性。结果显示，桑叶黄酮的最佳提取条件为微波功率175 W、 min、%、液料比30 mL/g，在此条件下，± mg/g。桑叶黄酮提取液对DPPH·、·OH和O2-·的清除作用明显，清除能力与黄酮提取液浓度呈正相关关系。综上，应用微波提取技术可有效提取桑叶黄酮，提取的黄酮具有良好的抗氧化活性。 Key：响应面分析法；桑叶；黄酮；抗氧化性 ： 文献标志码：A Optimization of Extraction Process by Response Surface Methodology and Analysis of Antioxidant Activity of Flavonoid from Mulberry Leaves LI Heng， TAN Jinyan， ZHOU Xianjiao* （Lingnan Normal University， Zhanjiang， Guangdong 524048， China） Abstract： The objective of this study was to optimize the extraction process of flavonoids from mulberry leaves and explore its antioxidant activity. The experiment selected microwave power， microwave time， ethanol concentration， solid-liquid ratio and extraction time as variables， the yield of flavonoids as the evaluation index. Single factor tests and Box-Behnken method were used to optimize the extraction process. The scavenging ability on 1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl （DPPH·）， hydroxyl radical （·OH） and superoxide （O2-·） free radicals of flavonoids from mulberry leaves were also tested to estimate the antioxidant activities in vitro. The results showed that： optimal extraction rate （± mg/g highest yield） could be achieved under the conditions of microwave power 175 W， microwave time min， ethanol concentration %， solid-liquid ratio 30 mL/g. The abi-lity of mulberry leaves flavonoids extract to scavenge DPPH·， ·OH and O2-· was great and scavenge ability was positively correlated with concentration of the extract. To sum up， microwave extraction technology can effectively extract of mulberry leaves flavonoids， leading to better antioxidant acti-vity. Keywords： Response surface methodology; mulberry leaves; flavonoids; antioxidant activity 桑樹（Morus alba L.）为桑科（Moraceae）桑属（Morus L.）多年生落叶乔木，在中国主要分布在南部和长江流域[1]。桑叶是桑树的叶片，也被称为“铁扇子 ”，作为主要产物大约占桑树地上总产量的64%[2]。《神农本草经》中记载桑叶寒，味甘甜和苦涩，归肺、肝经，具有疏散风热、清肺润燥、平肝明目、凉血止血等功效，可作为发散风热药。黄酮是桑叶中重要的功能成分之 一，具有抗氧化、辅助降血糖、辅助降血脂、调节人体免疫力和预防心脑血管疾病等作用[3-5]。 桑叶黄酮的提取方法有水浸提法、有机溶剂提取法、超声辅助法、微波辅助法等 [6-10]，其中微波提取法是一种利用电磁场的新方法，具有节能，省时，操作简单，提取效率高等优点，其影响因素主要有微波时间、微波功率、液料比和有机溶剂浓度等[11]。查阅文献，已有研究采用微波辅助提取法探讨了前三种因素对桑叶黄酮提取率的影响，但是仅采用水浸提法[8，9]，未考虑有机溶剂的影响。故本研究采用有机溶剂提取法对有机溶剂浓度、微波时间、微波功率、液料比四因素进行优化。响应面分析（Response surface methodology，RSM）是一种实验条件寻优的方法，近年来广泛用于各种活性物质提取条件的优化[12，13]，是降低开发成本、优化加工条件、提高产品产量的一种有效方法。本研究采用响应面分析法进行优化研究，并检测桑叶黄酮对1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、超氧自由基（O2-·）、羟自由基（·OH）3种自由基的清除作用，明确桑叶黄酮的体外抗氧化活性，为桑叶资源的进一步利用提供了理论参考。 1 材料与方法 试验材料 桑叶，采摘于四川省绵阳市三台县，经清洗、烘干、粉碎，过60目筛；芦丁标准品，光谱纯，购于国药集团化学试剂公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH），美国Sigma公司；其他试剂均为分析纯。 仪器与设备 FW-1750型粉碎机，永康市哈瑞工贸有限公司；N4S型紫外可见分光光度计，上海仪电分析仪器有限公司；P70D20N1P-G5（W0）型微波炉，广东格兰仕微波生活电器制造有限公司；RE52CS-2 型旋转蒸发仪，郑州南北仪器设备有限公司。 试验方法 桑叶黄酮提取工艺 桑叶原料经粉碎后过60目筛， g于500 mL的烧杯内，根据试验设计加入一定比例相应浓度的乙醇溶液，摇匀，浸泡10 min。用保鲜膜覆盖烧瓶口，放入微波炉，调节微波功率和微波时间进行提取，提取液离心，过滤，取上清液，用旋转蒸发器浓缩至50 mL左右，最后用该样品浓度的乙醇溶液将提取液定容至100 mL待用。 芦丁标准曲线绘制及桑叶黄酮提取率的测定 桑叶黄酮含量测定采用亚硝酸钠-硝酸铝比色法[14]。 mg芦丁标准品，以70% g/L芦丁标准溶液。分别取0、、、、、 mL芦丁标准溶液置于10 mL具塞试管中， mL 5%NaNO2溶液，反应10 min后， mL 10%Al（NO3）3溶液，混匀静置10 min，再加入3 mL的4%NaOH溶液，以70%的乙醇溶液定容至试管刻度线处，显色反应10 min。最后用70%酒精为空白参比，在最大波长紫外光510 nm处测定吸光度。以芦丁溶液的质量浓度为横坐标X，吸光度Y为纵坐标，得到标准曲线方程为Y=-，R?=。 mL代替芦丁标准溶液，按照以上步骤测定其在510 nm处的吸光度，根据标准曲线方程得到提取液中黄酮的质量浓度，按下式计算桑叶黄酮的提取率： 其式中：C为待测溶液中总黄酮浓度（mg/mL）；V0为样液定容后体积，此处为100 mL；V1为显色时溶液的定容体积，此处为10mL；V2为测定吸光度所用样液的体积，此处为1 mL；M为称量的桑叶质量， g。 单因素试验设计 改进李富兰等[15]的微波提取的方法，分别考察微波功率（100、175、250、325、400 W）、微波时间（2、3、4、5、6 min）、乙醇浓度（20%、30%、40%、50%、60%）、液料比（20、30、40、50、60 mL/g）和提取次数（1、2、3、4、5次）5个因素对桑叶黄酮提取率的影响，每组试验重复3次，取平均值。 响应面试验设计 采用Design-，综合各单因素试验结果，以桑叶黄酮提取率为响应面值，建立四因素三水平Box-Behnken模型。响应面因素水平如表1所示。 黄酮体外抗氧化性试验 （1）DPPH·自由基清除率测定 参照文献[16]方法并稍作修改， mL DPPH溶液（无水乙醇配制），混匀后室温暗处反应30 min后，置于517 nm波长处测定吸光值。同条件下， mL乙醇溶液为试剂空白、等浓度的芦丁溶液为阳性对照。平行测定3次取平均值，以下式计算清除率： 式中：A0（对照） mL DPPH+ mL无水乙醇的吸光值；A1（反应） mL DPPH+ mL样品溶液的吸光值；A2（空白） mL无水乙醇+ mL样品溶液的吸光值。 （2）羟自由基（·OH）清除率测定 根据Reference[17] mL样品溶液，加入9 mmol/L的[FeSO4] mL，再加入9 mmoL/L的水杨酸- mL，充分混匀， mmol/ mL，于37℃水浴锅下反应30 min，以蒸馏水为空白，在510 nm处测定吸光值。以相同体积的蒸馏水为空白对照， mL蒸馏水代替过氧化氢溶液消除样品溶液本底吸光值，以等浓度芦丁溶液为阳性对照，平行测定3次取平均值。以下式计算清除率： 式中：A0为空白对照吸光值；A1为样品溶液吸光值；A2为不含过氧化氢样品溶液的本底吸光值。 （3）超氧自由基（O2-·）清除率测定 采用邻苯三酚自氧化法[18]测定样品对超氧阴离子自由基的清除作用。 mL mol/L Tris-HCl缓冲液（pH ）于25℃水浴锅中预热20 min， mL 25℃预热的25 mmol/L邻苯三酚（ mol/L HCl配制），混匀后25℃水浴5 min， HCl（8 mol/L）終止反应，于325 nm波长处测定其吸光度； mol/L HCl溶液代替邻苯三酚时的吸光度。用蒸馏水做试剂空白，以芦丁溶液作阳性对照，平行测定3次取平均值。以下式计算清除率：
