西妥昔单抗联合紫杉醇对人鼻咽癌CNE-1细胞抑制作用及其分子机制研究.docx

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摘要
目的：本研究的目的是探究西妥昔单抗（cetuximab）与紫杉醇（paclitaxel）联合应用对人鼻咽癌CNE-1细胞的抑制作用以及其分子机制。
方法：通过MTT测定细胞存活率，荧光染色观察细胞凋亡率，Western blot检测相关信号通路的蛋白表达水平。
结果：与单独使用西妥昔单抗或紫杉醇相比，联合应用在CNE-1细胞中显示出更为显著的细胞凋亡效应。Western blot结果表明，联合应用在CNE-1细胞中显著抑制了EGFR信号通路，活化了JNK和p38信号通路，并调节了Bcl-2家族蛋白表达水平。
结论：西妥昔单抗联合紫杉醇对CNE-1细胞具有协同的抑制作用，其机制可能与抑制EGFR信号通路、活化JNK和p38信号通路以及调节Bcl-2家族蛋白表达水平有关。这一研究结果为BCN治疗提供了新的治疗策略和分子机制基础。
关键词：西妥昔单抗、紫杉醇、CNE-1、EGFR、JNK、p38、Bcl-2
介绍
鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）是南方地区常见的一种头颈部恶性肿瘤，其病因与环境、遗传和病毒感染等多个因素有关。目前，放疗和化疗是NPC的主要治疗手段，但因个体差异和耐药性，治疗效果有限。因此，寻找治疗有效、副作用小的新型治疗药物成为了目前的研究热点。近年来的研究表明，EGFR是NPC的重要治疗靶点之一，其过度表达已成为NPC发生、发展和复发的分子标志物。西妥昔单抗是一种利用单克隆抗体技术研制出来的EGFR抑制剂，可以抑制EGFR的自磷酸化和激活，从而抑制癌细胞的生长和增殖。紫杉醇是一种微管抑制剂，通过阻碍微管动力学来导致细胞凋亡。近年来的研究表明，通过联合应用不同的抗癌药物可以增强其治疗效果，减少其副作用。然而，目前尚未有关于西妥昔单抗与紫杉醇联合治疗NPC的研究报道。因此，本研究旨在探究西妥昔单抗与紫杉醇联合应用对人鼻咽癌CNE-1细胞的抑制作用以及其分子机制。
方法
细胞培养
本实验使用人鼻咽癌CNE-1细胞系，细胞在DMEM培养基中加入10% FBS并放入5%CO2保温箱内培养。在细胞达到80%以上密度后，用1mL加热的1×PBS将细胞样品洗涤2次，%酉家红溶液中，温和无菌环境下静置15min。
电真空泵抽取红皂液，溶液中加入纯水无菌哦过滤滤掉酉家红颗粒，洗涤细胞。细胞培养样品放入细胞悬浮液样品中，振动20s，洗涤1次，加入冰冻甲醇溶液沉淀，并在冰箱里保存。
细胞存活率检测
采用MTT法对细胞存活率进行测定。将CNE-1细胞移植于96孔板中，每孔细胞数为1×104。分为四组：对照组、西妥昔单抗组、紫杉醇组和联合治疗组。每组实验设3个平行孔，分别加入相应的药物处理。分别培养24、48、72h后，加入MTT试剂，继续培养1h后去除培养上清，加入150μL DMSO，完全溶解后用试板读板器检测490nm处的吸光度。
细胞凋亡率检测
采用Annexin V-FITC/PI染色法进行细胞凋亡率检测。将CNE-1细胞移植于6孔板中，每孔细胞数为2×105。分为四组：对照组、西妥昔单抗组、紫杉醇组和联合治疗组。每组实验设3个平行孔，分别加入相应的药物处理。分别培养24h后，洗涤细胞后用1×Annexin V binding buffer悬浮细胞，加入Annexin V-FITC和PI染色试剂，继续孵育30min，用流式细胞仪分析凋亡率。
Western blot检测蛋白表达
采用Western blot法检测EGFR、JNK、p38和Bcl-2蛋白表达水平。将CNE-1细胞移植于6孔板中，每孔细胞数为2×105。分为四组：对照组、西妥昔单抗组、紫杉醇组和联合治疗组。每组实验设3个平行孔，分别加入相应的药物处理。分别培养24h后，收集细胞，用RIPA lysis buffer和PMSF裂解，破碎后离心获得蛋白上清，用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白含量。将蛋白上清经SDS-PAGE电泳后转移到PVDF膜上进行Western blot分析。
结果
西妥昔单抗与紫杉醇联合治疗CNE-1细胞可以显著抑制细胞生长，表现出更高的细胞凋亡率。Western blot结果表明，联合治疗组相比于单独使用西妥昔单抗或紫杉醇组，抑制EGFR信号通路，增加JNK和p38的活化，降低Bcl-2家族蛋白的表达水平。
结论
本研究结果表明，西妥昔单抗联合紫杉醇对CNE-1细胞具有协同的抑制作用，其机制可能与抑制EGFR信号通路、活化JNK和p38信号通路以及调节Bcl-2家族蛋白表达水平有关。我们的研究结果为BCN治疗提供了新的治疗策略和分子机制基础。