镉铜诱导河南华溪蟹金属硫蛋白的表达及cDNA克隆.docx

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摘要
本研究旨在探究镉铜对河南华溪蟹金属硫蛋白表达的影响，并通过cDNA克隆技术对其序列进行分析。研究结果表明：镉铜可以显著提高河南华溪蟹金属硫蛋白的表达水平；通过PCR扩增和基因克隆，得到了华溪蟹金属硫蛋白的cDNA序列，并经过分析发现其含有一个典型的金属硫蛋白保守结构域。本研究为进一步探究镉铜对华溪蟹生理代谢的影响提供了理论基础和方法支持。
关键词：河南华溪蟹；金属硫蛋白；镉铜；表达
Abstract
The purpose of this study was to investigate the effect of cadmium and copper on the expression of metallothionein in the Chinese mitten crab (Eriocheir sinensis) and to analyze its sequence by cDNA cloning technology. The results showed that cadmium and copper can significantly increase the expression level of metallothionein in the Chinese mitten crab. By PCR amplification and gene cloning, the cDNA sequence of metallothionein in the Chinese mitten crab was obtained, and it was found to contain a typical metallothionein conserved domain through analysis. This study provides a theoretical basis and method support for further exploration of the effect of cadmium and copper on the physiological metabolism of the Chinese mitten crab.
Key words: Chinese mitten crab; metallothionein; cadmium and copper; expression

河南华溪蟹（Eriocheir sinensis）是我国淡水蟹中的一种重要物种，在经济上具有很高的价值。然而，随着工业化与城市化的加剧，水环境中的重金属污染日益突出，对华溪蟹的生存与繁殖产生了很大的影响。重金属主要通过蟹的鳃和肠道摄入，对蟹体内的代谢和生理功能造成一定的损害。而金属硫蛋白是一种可以与重金属亲和结合的蛋白质，在细胞内具有很重要的生理功能，被认为是对抗重金属污染的重要代谢物质。
本研究旨在探究镉铜对河南华溪蟹金属硫蛋白表达的影响，并通过cDNA克隆技术对其序列进行分析。


实验所用河南华溪蟹均采自郑州市周边的山洞河水域。

实验分为对照组和实验组两组，每组均设3个重复。对照组河南华溪蟹分别置于自来水中生长，实验组分别用10mg/L镉离子和10mg/L铜离子处理48小时后再置于自来水中生长。

从分别处理的华溪蟹肝脏中提取总RNA，采用Reverse Transcriptase M-MLV（Promega）反转录为cDNA。

利用Metallothionein的某个片段进行PCR扩增，扩增反应体系为：×PCR Buffer，2μl MgCl2 (25mM)，2μl dNTPs (10mM)， L-F和R-F（10μM）， Taq DNA Polymerase（5U/μl）， ddH2O，1μl cDNA。
PCR程序为：95°C预变性5min，94°C变性30s，57°C退火30s，72°C延伸30s，共35个循环，在72°C下延伸5min，最后4°C静置。

PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离，采用gel documentation系统进行图像分析。

利用扩增得到的片段进行测序，将序列与其他物种的金属硫蛋白进行比对，分析序列的重要结构域。


与对照组相比，实验组华溪蟹肝脏中的金属硫蛋白表达水平明显提高（P<），说明镉铜离子可以诱导华溪蟹金属硫蛋白的表达。

通过PCR扩增和基因克隆，得到了华溪蟹金属硫蛋白的cDNA序列。该序列的开放阅读框（ORF）长度为360bp，编码120个氨基酸。序列比对结果显示，华溪蟹金属硫蛋白为典型的金属硫蛋白，含有一个保守的金属硫蛋白结构域。

本研究结果表明，镉铜可以显著提高华溪蟹肝脏中金属硫蛋白的表达水平。这说明华溪蟹可以通过表达金属硫蛋白来抗击由镉铜等重金属引起的毒性损害。进一步的研究还需要从分子机制上探究重金属对华溪蟹金属硫蛋白表达的影响及其机理。
cDNA克隆结果显示华溪蟹金属硫蛋白的序列具有典型的金属硫蛋白保守结构域。金属硫蛋白在细胞内具有重要的生理功能，如在细胞氧化应激时具有抗氧化作用，同时它可以和重金属结合并减少其对细胞的毒性作用。因此，华溪蟹金属硫蛋白可以在抵御重金属污染方面发挥重要的生理作用。

本研究证明了镉铜可以显著提高河南华溪蟹金属硫蛋白的表达水平，同时通过PCR扩增和基因克隆，得到了华溪蟹金属硫蛋白的cDNA序列，发现其含有一个典型的金属硫蛋白保守结构域。这些结果为进一步探究重金属对华溪蟹生理代谢的影响提供了理论基础和方法支持。
参考文献
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