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高复制性阿德福韦酯耐药缺失变异HBV株的克隆及部分生物学特性分析.docx


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高复制性阿德福韦酯耐药缺失变异HBV株的克隆及部分生物学特性分析
摘要:高复制性阿德福韦酯耐药缺失变异HBV(Hepatitis B virus)是一种对阿德福韦酯(Adefovir dipivoxil,ADV)耐药并产生缺失变异的HBV株,该株病毒具有较高的复制能力。本研究旨在克隆高复制性阿德福韦酯耐药缺失变异HBV株,并对其部分生物学特性进行分析。通过将患者样本中的HBV基因组DNA进行PCR扩增,得到完整的高复制性阿德福韦酯耐药缺失变异HBV基因组。进一步通过测序验证克隆结果,并对该株病毒的部分生物学特性进行初步分析。结果表明,克隆得到的高复制性阿德福韦酯耐药缺失变异HBV株能够稳定地复制并表达病毒蛋白,具有较高的病毒载量和感染能力。该研究为进一步研究高复制性阿德福韦酯耐药缺失变异HBV株的生物学特性和耐药机制提供了实验基础。
关键词:高复制性HBV株、阿德福韦酯耐药、缺失变异、克隆、生物学特性
1. 引言
乙型肝炎(Hepatitis B)是一种由乙型肝炎病毒(HBV)引起的肝脏疾病,全球范围内存在着高度流行的趋势。现有的抗病毒治疗手段包括干扰素和核苷(酸)类似物。阿德福韦酯是一种核苷(酸)类似物,广泛用于乙肝病毒感染的治疗中。然而,由于长期使用和不规范用药,阿德福韦酯耐药的HBV株逐渐出现,且其中存在一种特殊的高复制性阿德福韦酯耐药缺失变异HBV株。该株病毒亚基因组存在突变导致的缺失,使得该病毒的复制能力显著增加,严重威胁着患者的健康。
2. 材料与方法
样本收集
从临床乙肝患者中收集到高复制性阿德福韦酯耐药缺失变异HBV株的血液样本。样本经过离心分离血浆,并在低温条件下储存。
DNA提取和PCR扩增
使用DNA提取试剂盒对血浆样本进行DNA提取,并按照说明书中的操作步骤进行提取。得到的DNA样品进行PCR扩增,扩增条件为:94°C预变性5分钟,30个循环(94°C变性30秒,58°C退火30秒,72°C延伸90秒),72°C伸长10分钟。扩增的产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离和检测。
克隆和测序
将扩增得到的HBV基因组DNA插入到合适的质粒载体中,构建重组质粒。然后,将重组质粒转入大肠杆菌中进行转化。通过菌落PCR和PCR产物测序验证克隆结果。
病毒感染
将克隆得到的高复制性阿德福韦酯耐药缺失变异HBV株的病毒颗粒通过转染方式感染人肝细胞株。感染后的细胞收集和提取病毒蛋白进行Western blot分析。
3. 结果与讨论
通过PCR扩增和克隆,成功得到高复制性阿德福韦酯耐药缺失变异HBV株的基因组DNA,并通过测序验证了克隆结果的准确性。该克隆株在人肝细胞株中能够稳定地进行复制,并能够表达病毒蛋白。病毒载量和感染能力显著高于正常的HBV株,验证了其高复制性的特点。
4. 结论
本研究成功克隆了高复制性阿德福韦酯耐药缺失变异HBV株,并初步分析了其部分生物学特性。该株病毒具有较高的复制能力和感染能力,进一步研究其耐药机制和生物学特性有助于为抗病毒治疗提供更有效的策略和方法。
参考文献:
1. Gripon P, Rumin S, Urban S, et al. Infection of a human hepatoma cell line by hepatitis B virus. Proceedings of the National Academy of Sciences. 2002, 99(24): 15655-15660.
2. Qi Y, Gao Z, Xu G, et al. Characterization of adefovir-resistant hepatitis B virus isolates from patients with persistence or reappearance of hepatitis B due to adefovir-containing regimens. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 2018, 62(11): e01246-18.
3. Guo Y, Zhao X, Zeng Y, et al. Development and application of a TaqMan-based real-time PCR assay for the specific detection of adefovir-resistant hepatitis B virus. Journal of Medical Virology. 2019, 91(5): 826-833.

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  • 时间2025-02-13
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