鹅胚成纤维细胞系的建立及鹅细小病毒细胞适应株的培育.docx

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一、前言
鹅细小病毒（Goosmallvirus，GeSV）是一种病毒，在家禽中广泛分布，主要为年轻禽类造成严重的呼吸系统疾病。该病毒属于黄病毒科（Picornaviridae），为正股单股RNA病毒，其宿主为家禽类，包括鸡、鸭、鹅等。近年来，鹅细小病毒的流行已引起人们的重视，因此，建立鹅胚成纤维细胞系并培育鹅细小病毒适应株，对于研究该病毒的分子生物学特性、流行病学研究以及开发相应的防控措施具有重要意义。
二、鹅胚成纤维细胞系的建立
鹅胚成纤维细胞是从鹅胚中的胚胎组织中分离出来的一类成纤维细胞，具有强大的增殖能力和一定的增殖周期，并可以在体外维持稳定的生长，其细胞学性质和分子生物学特征都可以作为外源基因表达、病毒生物学和基因工程等领域的模型工具。
1. 鹅胚的获取
鹅胚的获取是建立鹅胚成纤维细胞系的第一步，一般鹅胚要在孵化过程中收集，以防止胚胎死亡和异化。尽量选择发育良好、无畸形的鹅胚，切勿选择破损或温度异常的鹅胚。鹅胚必须在雏化之前收集，以保持其完整性和胚胎细胞活力。收集之后应尽快进行操作，避免胚胎过于老化。
2. 鹅胚成纤维细胞的分离和培养
鹅胚成纤维细胞的分离是建立鹅胚成纤维细胞系的重要环节，其细胞来源是鹅胚中的几个不同的组织，如心脏、肝脏、肌肉等。以携带子宫的部分作为工具，将鹅胚放在培养皿中，洒上70％的乙醇，大约10s-20s以后将其移至含有PBS的无菌离心管中，几分钟后去掉PBS，然后将鹅胚取出，去除子宫并用剪刀将其切成小碎片。用1-2 ml的明胶酶1X（量根据碎片大小而定）处理碎片20min-30min，接着用DPBS洗涤碎片至5-6次以彻底去除酶和明胶酶。碎片的结构破坏后，细胞会释放并附着在培养皿，形成适宜的细胞密度，并在固定细胞的培养基中增殖，就可以建立纤维母细胞系。
三、鹅细小病毒细胞适应株的培育
在鹅胚成纤维细胞系中引入鹅细小病毒，依照病毒感染的特点，对细胞系进行一系列的选择、筛选和培育，最终可获得鹅细小病毒细胞适应株。
1. 病毒的分离和扩增
将感染鸭或鹅的组织、呼吸道或黏膜取材放入含冰乙醇的离心管中，立即送到实验室，并在无菌条件下分离病毒。首先用DPBS清洗样品，将样品加入含有抗生素-抗真菌剂的DMEM培养基中，再通过超离心、过滤和梯度离心等方法进行纯化和浓缩，最终得到高浓度的病毒液。
2. 细胞对病毒的敏感性测试
将纤维母细胞放入96孔板，加入适当浓度的病毒，一般选取病毒最低致病量（TCID50）的1/10作为实验浓度。在肉眼下观察细胞的形态变化和存活情况，测定细胞存活率并制作小区细胞培养，计算小区细胞和病毒之间的置信度，选定生长良好的小区细胞为适应培养物。继续培养和扩增病毒几代，直至获得稳定的病毒细胞适应株。
3. 病毒分离和适应性培养方法的优化
如果鹅细小病毒对鹅胚成纤维细胞的感染适应性不佳，需要对病毒分离方法和细胞培养条件进行优化。优化方法包括增加病毒初始感染量、调整细胞密度和培养基成分、改变温度和保湿等生长环境条件，改变细胞培养时间和周期等。这些方法可以提高病毒对细胞的适应性，促进细胞对病毒的增殖能力和稳定性。
四、结论
建立鹅胚成纤维细胞系和培育鹅细小病毒细胞适应株是研究该病毒基础生物学特性及其防控措施的重要环节。鹅胚成纤维细胞系的建立，为病毒在体内的定量和定性研究提供了良好的细胞来源；病毒的分离和细胞适应株的培育，可为探究病毒的作用机制和发展相应防控措施提供实验基础和理论支持。随着病毒学和分子生物学等领域的进一步发展，此类细胞系的建立和病毒适应株的培育，将为该病毒的深入研究提供更多的技术支持和研究基础。