2025年实验二十五基因重组实验Ⅳ重组体的筛选与鉴定.docx

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书山有路勤为径，学海无涯苦作舟
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试验二十五 基因重组试验Ⅳ——重组体旳筛选与鉴定
[原理]
限制性内切核酸酶酶切鉴定：详细原理见试验二十一。
PCR反应鉴定：详细原理见试验十八。
[试剂]
1、DNA模板
2、引物
3、Taq DNA聚合酶
4、dNTPs（dATP、dGTP、dCTP、dTTP）
5、10×PCR 反应缓冲液：100mmol/L Tris-HCl pH ，500mmol/L KCl，15mmol/L MgCl2，%明胶
6、矿物油
超纯水
8、EcoR I酶解反应液（10×）: 1mol/L Tris-HCl , NaCl , MgCl2 。
9、Hind III酶解反应液（10×）：1mol/L Tris-HCl , 1mol/L NaCl , MgCl2 。
×TAE 电泳缓冲液：称取242克Tris，，100ml EDTA，，加蒸馏水至1000ml。
10、.凝胶加样缓冲液：%溴酚蓝、%二甲苯青FF、40%蔗糖水溶液（w/v）。
11、1%（%）琼脂糖凝胶：1×TAE 100ml含1g（）琼脂糖。
[器材]
1、DNA扩增仪
2、电泳仪、电泳槽
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3、微量移液器
4、紫外投射仪
5、
6、样品槽模板（梳子）
7、锥型瓶（100ml或50ml）
8、一次性塑料手套
9、凝胶成像系统
[操作环节]
1. 酶切反应体系旳建立（20μl反应体系）
按下表规定配制酶切反应体系
质粒DNA
6μl
10×Buffer
2μl
HindIII
1μl
H2O
10μl
EcoR I
1μl
混匀后置37℃水浴3h。
2. PCR反应体系旳制备(25μl反应体系)
按下表规定配制酶切反应体系
DNA
2μl

10×Buffer

dNTP


H2O

Primer-1

TaqE
1μl
Primer-2

50%甘油
2μl
混匀后，rpm离心30sec，然后按
94℃ 5min
94℃ 40sec
55℃ 40sec 35cycles
72℃ 90sec
72℃ 3min
3. 电泳：1%琼脂糖凝胶（酶切）%琼脂糖凝胶（PCR反应）
将20μl酶切和PCR产物进行电泳，观测成果。
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Vocabulary in Biochemical technology
A
Absorbance

吸光度
Absorbent
吸附剂
Absorption chromatography
吸附层析
Absorption spectrum
吸取光谱
Acrylamide, Aa/Acr
丙烯酰胺（单体）
Adenine, A
腺嘌呤
Affinity chromatography
亲和层析
Agarose
琼脂糖
Agarose gel electrophoresis，AGE
琼脂糖凝胶电泳
Allele specific oligonucleotide, ASO
等位基因特异性寡核苷酸杂交
Ammonium persulfate, AP
过硫酸胺
Angle rotor
角式转头
Anion exchange chromatography
阴离子互换层析
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C
Carrier ampholyte
载体两性电解质
Cation exchange chromatography
阳离子互换层析
Cellulose acetate membrane electro -phoresis，（CAME）
醋酸纤维薄膜电泳
Cellulose ion-exchangers
纤维素离子互换剂
Centrifuge
离心机
Centrifugal force
离心力
Centrifugal technique
离心技术
Coenzyme
辅酶
Column chromatography
柱层析
Cytosine, C
胞嘧啶
D
Denature gradient gel eletro -phoresis , DGGE
变性梯度凝胶电泳
Deoxyribonucleic acid, DNA
脱氧核糖核酸
Dialysis
透析
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Differential centrifugation
差速离心
Discontinuous PAGE
不持续聚丙烯酰胺凝胶电泳
E
Eletro-osmosis
电渗
Emission spectrum
发射光谱
Exclusion chromatography
排阻层析
G
Gel chromatography
凝胶层析
Gel filtration
凝胶过滤
Guanine，G
鸟嘌呤
H
Homogenizer
匀浆器
Holozymase
全酶
I
Ion-exchange chromatography
离子互换层析
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Ion-exchange gel
离子互换凝胶
Ion-exchange resin
离子互换树脂
Isoelectric focusing, IEF
等电点聚焦
Isoenzyme
同工酶
L
Ligand
配基
M
Melting temperature, Tm
溶解温度
Matrix
载体
Mobile phase
流动相
Molecular sieve filtration
分子筛过滤
N
N,N,N’,N’-methylenc
Bisacrylamide , Bis
N,N,N’,N’-四亚甲基 双丙烯酰胺
N,N,N’,N’-tetramethylethylenedi -
四甲基乙二胺
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amine, TEMED
O
Osmosis
渗透
P
Paper chromatography
纸层析
Partition chromatography
分派层析
Partition coefficient
分派系数
Photoelectric colorimetry
光电比色法
Plasmid
质粒
Polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE
聚丙烯酰胺凝胶
Polymerase chain reaction, PCR
聚合酶链反应
Primer
引物
R
Relative centrifugal force, RCF
相对离心力
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Restriction endonuclease ，RE
限制性内切酶
Restriction fragment length polymorphism, RFLP
限制性片段长度多态性
Rate zonal centrifugation
速率区离心法
Reverse osmosis
反向渗透
Revolution per minute ,rpm
每分钟转速
Ribonucleic acid, RNA
核糖核酸
Rotor
转头
S
Salting in
盐溶
Salting out
盐析
Saphadex
葡聚糖凝胶
SDS-PAGE
SDS-聚丙烯酰胺凝胶
Sedimentation coefficient
沉降系数
Sedimentation velocity
沉降速率
Sedimentation time,ST
沉降时间
Sepharose
琼脂糖凝胶
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Sequencing
测序
Single strand conformative polymorphism, SSCP
单链构象多态性
Sodium dodecyl sulfate, SDS
十二烷基硫酸钠
Spectrophotometer
分光光度计
Spectrophotometery
分光光度法
Stationary phase
固定相
Swing-out rotor
水平式转头
T
Thin-layer chromatography, TLC
薄层层析
Transmittance
透光率
Thymine, T
胸腺嘧啶
Transformation
转化
Transfection
转染
Transduction
转导
Transposition
转位
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U
Ultrafiltration
超滤
Uracil, U
尿嘧啶
V
Visible and ultraviolet Spectro -photometery
紫外可见分光光度法
Vector
载体