山西地方南瓜种质资源的RAPD分析.ppt

prehensive experiment
Analysis on ic Variation of Pumpkin Resources in Shanxi
山西地方南瓜种质资源的RAPD分析
实验原理
运用随机引物扩增寻找多态性DNA片段可作为分子标记。这种方法即为 RAPD (Random amplified polymorphic DNA ,随机扩增的多态性DNA)。该技术建立于PCR技术基础上,它是利用一系列不同的随机排列碱基顺序的寡聚核苷酸单链为引物, 对所研究基因组DNA进行PCR扩增,聚丙烯酰胺或琼脂糖电泳分离, 经EB染色或放射性自显影来检测扩增产物DNA片段的多态性,这些扩增产物DNA片段的多态性反映了基因组相应区域的DNA多态性。RAPD所用的一系列引物DNA序列各不相同,但对于任一特异的引物,它同基因组DNA序列有其特异的结合位点。这些特异的结合位点在基因组某些区域内的分布如符合PCR扩增反应的条件, 就可扩增出DNA片段。因此如果基因组在这些区域发生DNA片段插入、缺失或碱基突变就可能导致这些特定结合位点分布发生相应的变化, 而使PCR产物增加、缺少或发生分子量的改变。通过对PCR产物检测即可检出基因组DNA的多态性。分析时可用的引物数很大, 虽然对每一个引物而言其检测基因组DNA多态性的区域是有限的, 但是利用一系列引物则可以使检测区域几乎覆盖整个基因组, 因此RAPD可以对整个基因组DNA进行多态性检测。另外,RAPD片段克隆后可作为RFLP的分子标记进行作图分析。
主要内容
不同荞麦品种总DNA的提取;
总DNA的电泳检测;
RAPD分析;
电泳检测并进行统计分析;
实验材料和试剂
实验材料:荞麦幼嫩叶子。
实验所需试剂:
随机引物(10mer) (5μmol/L) 购买成品;
Taq 酶:购买成品;
10×PCR 缓冲液;
MgCl2 :25mmol/L;
dNTP:。
实验仪器
PCR仪
凝胶电泳仪和电泳槽
凝胶成像系统
实验步骤
1. 在25μL反应体系中,加入以下物质:
模板DNA 1μL (50ng) ; 随机引物 1μL (约5pmol) ; 10×PCR Buffer ; MgCl2 2μL ; dNTP 2μL; Taq酶 1单位(U);  加ddH2O 至 25μL; 混匀稍离心, 加一滴矿物油。
2. 在加热至90℃以上的PCR仪中94℃预变性 2 分钟, 然后循环: 94℃ 1分钟,38℃ 1分钟,72℃ 1 分钟,共40轮循环;
3. 循环结束后, 72℃ 10分钟,4℃保存;
4. 取PCR产物15μl加3μl上样缓冲液(6×)于2%琼脂糖胶上电泳, 稳压50-100V(电压低带型整齐, 分辨率高)
5. 电泳结束,观察、拍照。
典型的RAPD例图