产淀粉酶菌种的鉴定.ppt

实验八产淀粉酶菌种的鉴定
实验目的
;
rRNA基因PCR扩增进行细菌鉴定的基本原理并初步掌握PCR的操作技术;
。
实验原理
细菌分类鉴定的方法:
形态学特征的鉴定
生理生化特征的鉴定
分子特征的鉴定
形态学的鉴定
固体平板菌落,固体斜面,半固体穿刺,液体的培养特征;
显微镜下的细胞形状,革兰氏染色反应,抗酸性染色,是否具有芽孢(芽孢在细胞内的位置)、荚膜和鞭毛(鞭毛着生的位置)等。
分子鉴定
16SrDNA 是编码原核生物核糖体RNA小亚基16SrRNA 的基因,与细菌整个基因组的变化相比,它具有高度的保守性,其变化的概率与细菌的变异和进化程度是一致的,所以有助于细菌的鉴定和分类。结合完善的数据库,16SrDNA 序列分析可以快速准确的对细菌进行种属鉴定,确定细菌在进化中的位置。
16SrDNA 序列包含10个可变区和与之相间的11个恒定区。根据恒定区的保守性可以设计出细菌的通用引物,并且扩增出所有细菌的16SrDNA 片段。可变区因细菌而异,能够揭示生物物种特征核酸序列,是种属鉴定的分子基础。
扩增细菌的16SrDNA 基因需要其染色体DNA 作为模板进行PCR, 可以提取细菌染色体DNA 作为模板,也可以直接挑取平板上经过活化的菌落做PCR 以达到快速简便的目的。
5’
5’
3’
3’
PCR Cycle 1
Denaturation
95 ℃
strands separate
Primers
Taq
Taq
Taq polymerase is thermostable
3’
5’
5’
3’
Annealing
59 ℃ Primers bind
Taq
Taq
Forward primer anneals to lower strand
Reverse primer anneals to upper strand
PCR Cycle 1
3’
5’
5’
3’
Taq synthesises DNA in the 5’ to 3’ direction
PCR Cycle 1
Taq
Taq
Extension
72 ℃
Taq copies DNA strand dNTPs
琼脂糖凝胶电泳的原理
原理:
带电颗粒在电场的作用下,向着与其电性相反的电极泳动的现象。
在本实验中,DNA分子带负电荷,向正极泳动。
影响泳动率的因素:
电荷效应和分子筛效应(即DNA分子本身的大小和构型)。
在本实验中,分子量越小,泳动越快。