引物设计实例分析GFP融合蛋白引物设计引物设计基本原则引物.doc

引物设计实例分析(GFP融合蛋白引物设计)
引物设计基本原则
引物长度(primer length)
产物长度(product length)
序列Tm值(melting temperature)
G+position)
引物二聚体及发夹结构(duplex formation and hairpin)
阅读框
1. 引物的长度
一般为15-30bp,常用的是18-27bp,但不能大于38,因为过长会导致其延伸温度大于74℃,即Taq酶的最适温度
2. 产物的长度
扩增片段长度为100~600碱基对。
3. Tm值
引物的Tm值一般控制在55-60度, 尽可能保证上下游引物的Tm值一致,一般不超过2度。如果引物中的G+C含量相对偏低,则可以使引物长度稍长,而保证一定的退火温度。
Tm=2(A+T)+4(C+G)
4. 引物的GC含量
有效引物中(G+C)的比例为40-60%,过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。
5. 引物自身
引物间3‘端的互补、二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败
任务
用绿色荧光蛋白(GFP)标记蛋白NR1
引物要求
PCR扩增GFP
GFP两边添加BamHI酶切位点
保证NR1的阅读框不改变
第一步:扩增GFP基本序列
第二步:GC比值;Tm值
第三步:酶切位点
第四步:阅读框
第五步  保护序列
Primer1: 5'    TATGGTGAGCAAGGGCGAGGA
Primer2: 5'  
记得当初写本科论文,感到不知道讨论什么问题好。愣是写了一大段的PCR条件摸索的讨论。后来PCR成为实验最基本的一步了,但是发现在PCR中还是有许多需要注意的地方。PCR的第一步就是引物设计了。引物设计需要注意的地方很多,在大多数情况下,我们都是在知道已知模板序列时进行PCR扩增的。在某些情况比如构建文库的时候也会在不知道模板序列的情况下进行设计。这个时候随机核苷酸序列就与模板不是完全匹配。我们通常指的设计引物都是在已知模板序列的情况下进行。
 
设计的目的是在两个目标间取得平衡:扩增特异性和扩增效率。引物分析软件将试图通过使用每一引物设计变化的预定值在这两个目标间取得平衡。设计引用有一些需要注意的基本原理:
①引物长度
一般引物长度为18~30碱基。总的说来,决定引物退火温度(Tm值)最重要的因素就是引物的长度。有以下公式可以用于粗略计算引物的退火温度。
在引物长度小于20bp时:[4(G+C)+2(A+T)]-5℃
在引物长度大于20bp时:℃+℃(%G-C)-500/length-5℃
 
另外有许多软件也可以对退火温度进行计算,其计算原理会各有不同,因此有时计算出的数值可能会有少量差距。为了优化PCR反应,使用确保退火温度不低于54℃的最短的引物可获得最好的效率和特异性。
 
总的说来,每增加一个核苷酸引物特异性提高4倍,这样,大多数应用的最短引物长度为18个核苷酸。引物长度的上限并不很重要,主要与反应效率有关。由于熵的原因,引物越长,它退火结合到靶DNA上形成供DNA聚合酶结合的稳定双链模板的速率越小。
 
② GC含量
一般引物序列中G+C含量一般为40%~60%,一对引物的GC含量和Tm值应该协调。若是引物存在严重的GC倾向或AT倾向则可以在引物5’端加适量的A、T或G、C尾巴。
 
③退火温度
退火温度需要比解链温度低5℃,如果引物碱基数较少,可以适当提高退火温度,这样可以使PCR的特异性增加;如果碱基数较多,那么可以适当减低退火温度,是DNA双链结合。一对引物的退火温度相差4℃~6℃不会影响PCR的产率,但是理想情况下一对引物的退火温度是一样的,可以在55℃~75℃间变化。
 
④避免扩增模板的二级结构区域
选择扩增片段时最好避开模板的二级结构区域。用有关计算机软件可以预测估计目的片段的稳定二级结构,有助于选择模板。实验表明,待扩区域自由能(△G),扩增往往不能成功。若不能避开这一区域时,用7-deaza-2’-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的。
 
⑤与靶DNA的错配
当被扩增的靶DNA序列较大的时候,一个引物就有可能与靶DNA
的多个地方结合,造成结果中有多个条带出现。这个时候有必要先使用BLAST软件进行检测,网址:.gov/BLAST/。选择Align two sequences (bl2seq),如下图。
 
 
BLAST的使用方法也十分简单,如下图所示。
 
将引物序列粘贴到1区,将靶DNA序列粘贴到2区,这两者可以互换的,并且BLAST会计算互补、反义链等多种可能,所以不需