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荧光原位杂交
荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization, FISH)
荧光原位杂交是在20世纪80年代末在放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性分子细胞遗传技术,以荧光标记取代同位素标记而形成的一种新的原位杂交方法,探针首先与某种介导分子(reporter molecule)结合,杂交后再通过免疫细胞化学过程连接上荧光染料.
荧光原位杂交
FISH的原理
FISH的操作及应用
FISH的展望
FISH的原理
FISH的基本原理是用已知的标记单链核酸为探针,按照碱基互补的原则,与待检材料中未知的单链核酸进行特异性结合,形成可被检测的杂交双链核酸。由于DNA分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排列,因而可以将探针直接与染色体进行杂交从而将特定的基因在染色体上定位。
目前这项技术已经广泛应用于动植物基因组结构研究、染色体精细结构变异分析、病毒感染分析、人类产前诊断、肿瘤遗传学和基因组进化研究等许多领域。。
荧光原位杂交
原有的放射性同位素原位杂交技术存在着较多缺点,诸如每次检验均需重新标记探针,已标记的探针表现出明显的不稳定性,需要较和时间的曝光时间和对环境的污染等。在观察结果时,需要较多的分裂进行统计学分析。此外,由于放射性银粒和染色体聚集的不同平面,可能引起计数上的误差等。
与之比FISH的优点
①操作操作简便,探针标记后稳定,一次标记后可使用二年
②方法敏感,能迅速得到结果
③在同一标本上,可同时检测几种不同探针.
④不仅可用于分裂期细胞染色体数量或结构变化的研究,而且还可用于间期细胞的染色体数量及基因改变的研究. 缺点:不能达到100%杂交,特别是在应用较短的cDNA探针时效率明显下降。
荧光原位杂交
FISH技术包括下列几个步骤:
1)探针的制备和标记
2)探针及标本变性
3)杂交
4)洗脱
5)杂交信号的放大(适用于使用生物素标记的探针)
6)封片
7)荧光显微镜观察FISH结果
荧光原位杂交
单拷贝探针:
(1)种类:YAC, BAC, Cosmid,Plasmid, cDNA片段 (2)应用 (a)定位DNA片段及嵌合体克隆验证; (b)确定染色体微小缺失与重复; (c)染色体断裂点分析。 (d)间期细胞染色体数目异常诊断。
荧光原位杂交
单拷贝探针
DNA片段的染色体定位
荧光原位杂交
单拷贝探针
FISH检测微小缺失
荧光原位杂交