酶学实验四 碱性蛋白酶活力的测定.docx

实验四碱性蛋白酶活力的测定
(赖凌峰李佳佳邓仕彬)
一、原理
以酪蛋白为底物测定碱性蛋白酶的活力。酪蛋白经蛋白酶作用后,会降解成相对分子质量较小的肽和氨基酸,在反应混合物中加入三氯醋酸溶液,相对分子质量较大的蛋白质和肽就沉淀下来,相对分子质量较小的肽和氨基酸仍留在溶液中。溶解于三氯醋酸溶液中的肽的数量正比于酶的数量和反应时间。因而采用Folin 法测定上清液中肽的含量就可以计算酶的活力。
二、试剂
1、 碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液(pH10)
2、5%三氯醋酸
3、1%酪蛋白溶液:
称取5g 酪蛋白置于500mL 碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液(pH10)中,加热使其溶解。
4、 碳酸钠溶液
5、100μg/mL 酪氨酸溶液
6、Folin 试剂,稀释3 倍使用
如果自己配制,可按下法:于2000mL 磨口回流装置内加入钨酸钠()100g,钼酸钠()25g,加水700mL,85%磷酸50mL,浓盐酸100mL,文火回流10 小时。取下回流冷凝器,加入硫酸锂50g,水50mL 和浓溴水(99%)数滴,再煮沸15min,以除去多余的溴(冷后仍有绿色需再加溴水),冷却,加水定容至1000mL,混匀,过滤,制得的试剂应显金黄色,贮于棕色瓶内。
三、步骤
1、酶液的萃取
称取1g 粗酶制剂置于研钵中,加少量缓冲液一起研磨,然后定容至100mL,从容量瓶中取出5mL 酶液(视酶活而定)再定容至100mL,稀释后的酶液经滤纸过滤后得到澄清的酶液。
2、酶活力的测定
样品管:
取不同量的酶液(,,), 碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液(pH10),然后在每个样品管中再加入1mL 预先在40℃保温的1%酪蛋白溶液,混匀并开始计时,在40℃准确保温10min,加入2mL 5%三
氯醋酸溶液,迅速摇匀,于室温静置半小时。
空白管:
1% 5%三氯醋酸溶液,摇匀后,,酶液浓度分别与对应的样品管相同,在40℃下准确保温10min,以下操作同样品管。
将酶反应混合物过滤后收集滤液,在1mL 滤液中加5mL 碳酸钠溶液和1mL Folin 试剂,摇匀后在40℃恒温水浴中显色20 min,以相应的空白管中的反应液为对照,在680nm 下测定样品管中反应液的吸光度。
3、酪氨酸标准曲线
为了确定酪氨酸与OD值的对应关系,需事先用不同浓度标准酪氨酸溶液与Folin 试剂反应显色,测定OD 值标准曲线。
(1)不同浓度的标准酪氨酸溶液按下表配制:
管
号
酪氨酸的浓度
(μg/mL)
100μg/mL
酪氨酸溶液(mL数)
蒸馏水
(mL数)
空白
0
0
1
1
10


2
20


3
30


4
40


5
50


6
60


(2) 碳酸钠溶液5mL,Folin 试剂1mL,置于40℃恒温水浴显色2