dna限制酶切反应和限制酶谱绘制.ppt

1. 酶单位定义: 使1μg某种DNA在最适反应条件下和1小时内完全酶切所需的限制酶活性。
2. 酶切反应类型
1) 完全酶切 SV40(5243bp) pBR322(4363bp)

2) 部分酶切
3. 酶切反应最适条件
1) DNA分子的组成
i. 碱基组成与排列方式
ii. 识别位点两侧的碱基组成与排列方式,同一DNA分子中不同识别位点的酶切速度可相差10倍(如λ中的EcoRI位点)
2) 反应条件
           i. DNA溶液的纯度和浓度(反应浓度)
依实验目的而定
HpaI(C CGG) 1 26
ThaI (CG CG) 0 23
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ii. 限制酶的纯度和稳定性
i) 纯度:尽可能保持厂家推荐的反应条件
ii) 稳定性:保存和反应
iii. 反应缓冲液:常用三种核心缓冲液,即高(H),中(M),低(L)盐缓冲液,不同温度下的pH值
iv. 反应温度:大多数为37℃
v. 双酶切和多酶切反应
同时酶切和分别酶切。前者要求两种酶使用的缓冲液和反应温度必须相同,即使相同时,一旦发生部分酶切反应,便无法判断是何种酶造成的,因此最好采用后者--分别酶切。
i) 第一种酶切电泳检查酚/氯仿纯化第二种酶切。
可不考虑酶切先后顺序,但操作步骤多。
ii) 采用低浓度盐缓冲液的限制酶切电泳检查采用高浓度盐缓冲液的限制酶切。操作简单,但要分先后。
假如两酶切位点相距很近(如多克隆位点区),首先考虑的则是相互间的酶切是否有影响,两种酶切顺序不同时,其结果大不相同。
如SmaI-BamH(c), BamHI-SmaI(p)
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二、限制酶图谱的绘制
1. 完全酶切作图法
1)单酶切作图法
一长度为5Kb的线状DNA分子用两种限制酶完全酶切的凝胶电泳结果和各位点的可能性排列。要确定其位置,可采用下述辅助方法之一。
i. 单酶部分酶切:部分酶切时,各种可能性均存在,但只有相邻的两个DNA片段才有可能出现在凝胶上。
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ii. 末端标记完全酶切
DNA片段末端标记完全酶切凝胶电泳 EtBr染
色观察放射自显影
2) 双酶切作图法
单酶切结果只能确定一种酶的位点,要将两种单酶切结果画在一张图上时则不行
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分别作图时,同一种酶的两种作图法都是对的,但当作在一张图上时,上述两种可能性中只有一种是对的,因此必须进行双酶切反应,其结果见图
根据上述的原理和步骤,前述的5 Kb片段酶I与酶II的定位结果可用两种方法之一:
i) 单酶切分离DNA片段第二种酶切凝胶电泳
ii)单酶切第二种酶切凝胶电泳
*如果要同时将两种限制酶定位在一条DNA上时,单酶完全酶切作图就没必要了。
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2. 末端标记-部分酶切作图法(Smith-Brinstiel法)
DNA片段末端标记
酶1切分离带标记
DNA片段酶2部分酶切电泳 EtBr染色照相放射自显影
结果
单端标记方法:
人工合成单端标记法
限制酶切单端标记法
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单端标记方法1
人工合成单端标记法
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单端标记方法2
限制酶切单端标记法
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3. 末端标记双相作图法
方法2仍存在两个不足之处:①酶1的选择不能靠近DNA中央;②需先分离DNA片段,该法可克服上述缺点。
现假设有一片段长10 Kb,其中RE1有三个切点,RE2有一个切点,其图谱可能是:
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4. Bal31顺序酶解作图法
DNA片段 Bal31处理不同时间取样终止反应限制酶切
凝胶电泳染色观察结果
5. 切口移位作图法(可检测出100bp片段)
双链DNA 切口移位限制酶切电泳放射自显影
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