四川大学-生物技术-综合实验报告-学生版.doc

生物技术综合实验
甘薯γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)基因的克隆和原核表达
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同实验者:
<研究背景>
谷胱甘肽(glutathione, GSH) GSH具有多种重要生理功能, 抗自由基和抗氧化应激作用, 保护细胞膜的完整性等。γ-GCS是植物细胞中GSH生物合成的限速酶, 可以调控GSH的生物合成量。GSH在生物体抵御冷害、干旱、重金属、真菌等胁迫过程中起着重要作用, 说明γ-GCS也与植物抗逆过程密切相关。
实验一甘薯叶片RNA提取
一、实验目的
1. 了解真核生物RNA提取的原理;
2. 掌握Trizol提取的方法和步骤。
实验原理
Trizol 试剂是由苯酚和硫氰酸胍配制而成的单相的快速抽提总RNA的试剂,在匀浆和裂解过程中,能在破碎细胞、降解细胞其它成分的同时保持RNA的完整性。TRIzol的主要成分是苯酚。苯酚的主要作用是裂解细胞,使细胞中的蛋白,核酸物质解聚得到释放。苯酚虽可有效地变性蛋白质,但不能完全抑制RNA酶活性,因此TRIzol中还加入了8-羟基喹啉、异硫氰酸胍、β-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase(RNA酶)。%的8-羟基喹啉可以抑制RNase,与氯仿联合使用可增强抑制作用。异硫氰酸胍属于解偶剂,是一类强力的蛋白质变性剂,可溶解蛋白质并使蛋白质二级结构消失,导致细胞结构降解,核蛋白迅速与核酸分离。β-巯基乙醇的主要作用是破坏RNase蛋白质中的二硫键。在氯仿抽提、离心分离后,RNA处于水相中,将水相转管后用异丙醇沉淀RNA。用这种方法得到的总 RNA中蛋白质和DNA污染很少。
实验材料
材料
甘薯(Ipomoea batatas Lam)叶片,品种为徐薯18
2. 试剂
①无RNA酶灭菌水:%的DEPC,处理过夜后高压灭菌;
② Trizol试剂;
③氯仿;
④异丙醇、75%乙醇;
⑤ TBE缓冲液;
⑥上样缓冲液(6×)
3. 仪器
高压灭菌锅、微量移液器、台式离心机、超净工作台、电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、、枪头和EP管架
实验方法
1. 将叶片取出放入研钵中,加入适量液氮,迅速研磨成粉末,每50-100 mg植物叶片加入1 mL Trizol试剂,室温放置5 min,使样品充分裂解;
2. 每1 mL Trizol试剂加入200 μL氯仿,用手剧烈振荡混匀后室温放置3-5 min使其自然分相;
3. 4℃ 12,000 rpm 离心15 min,吸取上层水相转移到新管中;在上清中加入等体积冰冷的异丙醇,室温放置15 min;
4. 4℃ 12,000 rpm 离心10 min,弃上清,RNA沉淀于管底;
RNA沉淀中加入1 mL 75%的乙醇(用RNase-free水配制),温和震荡离心管,悬浮沉淀; 4℃ 8,000 rpm离心2 min,弃上清;
室温放置10 min晾干沉淀;
沉淀中加入20μL RNase-free ddH2O,轻弹管壁,以充分溶解RNA,-70℃保存;
用1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测,用EB染色并照相。
实验结果
RNA提取结果
依照Trizol 试剂盒方法,提出的RNA较少,此部分未以图或数据显示。
2. RNA后电泳结果
如图1. 其中9a为本组实验结果。由图可知RNA条带非常模糊,拖尾现象严重,几乎无法分清具体条带,亮度较大。点样孔附近的红色部分为杂质,在提取过程中并未很好除去。
图1. RNA提取跑胶结果。其中1泳道为样品Marker,9a泳道为本小组RNA样品。与标准对照可见条带模糊,拖尾现象严重。
分析与讨论
1. RNA的提取
产量并不多,可能是因裂解样品不充分或RNA沉淀未完全溶解所致。在实验过程中,由于对操作时间的掌握不熟练、操作技巧不完善,留上清与弃上清时令RNA损失了部分,使最终RNA产量不理想。
2. RNA电泳结果
有EB存在时,电泳后28S rRNA和18S rRNA在紫外灯下应看得很清楚,另出现条由tRNA, rRNA和5S rRNA组成的较模糊、迁移较快的带。如果RNA没有降解,则28S rRNA的亮度应为18S rRNA的2倍,且这两条带都无弥散现象发生。由图1. 9a可知,RNA拖尾现象严重,说明RNA已大部分被降解;此外点样孔附近出现红色部分杂质,分析可能有并未除尽的蛋白质,同样影响RNA电泳结果。
在进行实验时,本小组成员未严格戴上口罩并勤换手套,这可能使外源RNAase进入样品,导致其降解严重。另外,提取出RNA后本小组未立即将样品放入-70℃保存,也为导致结果不理想的重要原因之一。在最初用氯仿萃取分层的过程中,由于水相吸取过多,掺杂入部分蛋