Primerpremier50设计pcr引物.doc

安装软件Primer 。
程序下载:Primer Premier  t/2005/
程序中双击打开
点FILE---NEW—DNA SEQUENCE如图所示。
输入目的基因片段,可以复制后用ctrl+V键拷贝到栏内,后应加数个N以备后续设计时加酶切位点及保护碱基,如图所示。
选中enzyme图标,将所选质粒上的多克隆酶切位点加入左栏
6. 选中OK键,分析目的基因中所含的酶切位点,选插入位点时就应排除这些酶
,点S图标,edit primer,开始设计正义链。
8. 软件默认引物为25个碱基
9. 可将鼠标点在设计框的3端从右向左删除7-9个碱基,保留16-18个配对即可
,入该图加入HIND III酶切位点及TTA保护碱基,完成后点analyze,认为可以后点OK。
11. 选中左上角A图标,用鼠标拉动滑块将待选引物放至目的基因末端。如图,选中EDIT PRIMERS图标,开始设计反义链。
12. 从3端删除7-9个碱基同正义链。
13. 将酶切位点加在5端,应将产品目录所示的酶切位点序列从右至左加入(注意不要加反)如图加入BamH I酶切位点及CGC3个保护碱基。完成后点analyze,认为可以后点OK。
14. 最后分析结果如图,反义链的FALSE PRIMING可以不考虑,RATING表示引物评分也可以不考虑,主要看Tm值正义链和反义链相差不应超过3度。GC含量不应超过60%
15. 该软件有个缺点,不能保存分析结果,只能选择打印
16. 如果设计RT-PCR检测的引物就如下所示。同上输入目的基因片段,选SEARCH图标,选择参数,一般选PCR primers---both—100至250个碱基,引物长短20+/-2,search parametere中的参数可以不选,为默认设置。点OK。
17.
,点OK.
19. 点SENES选择正义链,RATING表示引物评分,最好选评分高的。
20. 点ANTI-SENSE,相同方式选择反义链。整个一队引物评价同目的基因克隆的引物设计相同