浙江大学肿瘤研究所流式细胞分选服务预约注意事项.doc

浙江大学肿瘤研究所流式细胞分选服务预约注意事项
一、服务项目
无菌细胞分选: 各种细胞系、原代细胞、肿瘤组织单细胞悬液、骨髓等
特殊细胞分选或其他项目:请联系管理员葛维挺(******@zju. 0571-87767022)。
本仪器以分选为主,分析与分选收费标准相同,建议事先使用其它流式细胞仪确认细胞阳性染色比例。
二、特别注意
安全性问题:由于在分选过程中,样本可能通过液滴震荡产生气溶胶,所以不接受会传播人类病原菌的生物有害样本,也不接受含放射性生物样品。
应知道细胞的大小与形态,以便选择分选用喷嘴。所分选细胞的直径最好小于喷嘴直径的1/5,至少小于1/3。细胞的形态也会影响了分选的结果,理论上越接近于球形的细胞,分选过程中的剪切力对细胞造成的伤害就越小。形态特殊的细胞应选择较大的喷嘴,以减轻分选过程对细胞造成的伤害。
各种细胞的建议浓度和所用喷嘴如下表。
Table 1 细胞种类和浓度、喷嘴的选择
细胞种类
浓度
喷嘴
Lymphocytes, thymocytes or splenocytes (直径8-12 μm)
8 - 12 × 106 /ml
85μm
Activated lymphocytes, smaller cell lines (直径12-20 μm)
7- 9 × 106 /ml
85μm
Large adherent cell line (直径>20 μm)
5 - 8 × 106 /ml
100μm
荧光染料的选择:如选择1到4个荧光标记,一般按如下顺序选择,FITC、PE、APC和PerCP。
三、样本制备
样本制备基本流程:
获取细胞悬液→荧光抗体染色→调整细胞浓度(参考Table 1)→避光置冰上运至分选室→移入带过滤头的流式管→上机检测并设定分选条件→试分选并上机检测纯度→分选细胞。
分选所用的细胞染色方法与分析所用方法基本相同,但需要注意以下几点:
保证样本的无菌状态,因为分选得到的细胞还要继续培养
不同使用固定剂固定细胞,因为活细胞经固定剂处理后即死亡
保证上机样品为单细胞悬液(我们提供带过滤头流式管(Falcon Cat# 352235))
准备充足的细胞,详见FAQ3
分选缓冲液使用含2%FBS 或BSA的PBS,普通培养基中的酚红可能会干扰分选
如细胞分选后需再次培养,请准备含血清的收集管,在分选前交操作员。建议在15ml离心管中加入1-2ml血清及其它必需组分,保证分选完毕时血清浓度大于5%
如要分选GFP等转染的样品,请提供未经转染的相同细胞为阴性对照
如要做多重荧光染色标本的分选,请提供各种单一荧光染色的标本
如要去除死细胞,在不影响后续实验前提下,可以加入7-AAD或是PI
快速简便的样本处理有利于分选:处理好的样本尽快上机,分选好的细胞尽快下一步实验,如果要分选多个样本,建议一次处理一个,估计可能的上机时间后,再处理第二个样本

Q1. 上机样品需要溶在何种溶液中?是否可以就直接放在原本培养的培养基中?
Ans: 建议不要放培养基中,因为Phenol Red可能会影响分选的结果,可先尝试使用含2%FBS 或BSA的PBS作为分选缓冲液。如要求更好的细胞存活率,按分选细胞的不同,选择不同的分选缓冲液。