尖吻蝮蛇去整合素基因克隆与功能分析.pdf

尖吻蝮蛇去整合素基因克隆与功能分析��要�蛇毒中含多种具有生物活性的蛋白质,在抗血栓、止血、镇痛和抗肿瘤等多研究目的:抗血小板药物是抗血栓药物中非常重要的一类,血小板膜糖蛋白����痩��即整合素啦��阻断药是第三代抗血小板药,它可阻断血小板凝集的最终通路,不仅具有极强的抗血小板凝集作用,而且不会增加出血危险性。目前应用于临床的���琁��瓒弦┲饕R园⑽舻タ埂�L娣前碗摹⑻媛薹前辔4�恚�但这些药物来源困难,国内应用目前主要依赖进口,价格居高不下,很难满足我国普通民众的医疗需要,因此迫切需要我们自己研发一种可大量制备,工艺简便,成本低廉的抗血小板新药。方面具有良好的应用前景。蛇毒去整合素是蛇毒前金属蛋白酶原的加工产物,它可阻断����,�、奶�整合素与其配体结合,具有抑制血小板聚集、抗肿瘤、诱导血管内皮细胞凋亡等功能。蛇毒成分复杂,从蛇毒中直接分离目的蛋白不但难度高、工艺繁琐,而且蛇资源日益溃乏,蛇毒来源受限,若应用分子生物学方法体外表达蛇毒蛋白,则可大大降低生产成本,提高蛋白质产量。基于以上目的,我们从广西产尖吻蝮蛇毒腺中提取���τ没�蚬こ谭�法克隆表达一种新的去整合素,并对其生物学功能进行了初步分析。研究内容与结果;��馕球笊呷フ�纤鼗�蚩寺∮胄蛄蟹治�本研究从广西产尖吻蝮蛇毒腺组织提取了总����醋B蓟竦昧薱��学位申请人:姜升阳申请学科门类和级别:医学硕士指导教师:许金波韩颖专业名称:病理学与病理生理学年级:��级学号:���专业代码:培养单位:军事医学科学院野战输血研究所硕上学位论文:尖吻蝮蛇去整合素基因克隆与功能分析���
获得的去整合素基因片断,经酶切处理后插入��.��靥宓尿蟤�头污鮅�杂蛋白,但以去整合素融合蛋白为主,纯度较高。毒去整合素基因,并构建了原核表达载体,初步纯化了表达出的融合蛋白,活性序列,扩增出了���幕�蚱�危�⒐菇�似淇寺≈柿����。序列分析表明,该片断包含一个编码�个氨基酸残基的���叨救フ�纤鼗�颍�瑽�膖检索,该去整合素基因和其它蛇毒去整合素的基因同源性最高为�%,推导氨基酸序列的同源性最高为�%,但它含有蛇毒去整合素典型的���幕�蚣��个位置和数量保守的半胱氨酸残基,所形成的�员J囟�蚣��制涓呒督峁埂����吮泶镌靥宓墓菇�根据表达载体多克隆酶切位点信息重新设计引物,用新设计的引物再次扩增酶切位点之间,构建了原核表达质粒��.���捎谘∮玫脑靥宕�斜嗦肼笱�糖结合蛋白���膍���颍�泶锍龅娜诤系鞍状�蠱�标签。��诤系鞍椎谋泶镉氪炕�将构建的原核表达载体转入��こ叹�蠼�蠭��盏急泶铮�峁�允荆�表达的融合蛋白约为��左右,符合预期大小。在�℃诱导时融合蛋白主要以包涵体形式存在,而经�℃低温诱导后,融合蛋白以可溶性表达为主。由于融合蛋白中的��月笱刻呛椭绷吹矸劬哂懈叨惹缀托裕�颐茄∮昧薃���树脂柱对它进行纯化,结果显示,经过初步亲和纯化的蛋白中虽然仍含有少许其它��诤系鞍滋逋庖种蒲P“寰奂�钚猿醪椒治�本研究对初步纯化的融合蛋白进行了体外血小板聚集抑制试验,以经同样处理未插入外源基因的载体表达蛋白为对照,结果表明,重组融合蛋白在终浓度为��/�时即可抑制血小板聚集,��,�时血小板聚集活性几乎完全丧失,而对照蛋白在相同剂量条件下对血小板聚集几乎没有影响,因而我们认为重组的去整合索蛋白具有抑制血小板聚集的功能。结论:本研究利用分子生物学方法从广西尖吻蝮蛇毒腺组织中获得了一个新的蛇分析结果表明,该重组的去整合素蛋白具有血小板聚集抑制功能,这为进一步探讨该蛋白的其它生物学功能奠定了一定的基础。关键词:尖吻蝮蛇去整合素基因工程血小板聚集硕士学位论文:尖吻蝮蛇去整合素基阑克隆与功能分析�
俺患悠鲧��萬姗删����舶�阫谢扭��如�躢姗嘏.�搬��上Ⅺ加�Ъ尤珉��癴淞�������������〆��������������������珽��咚篸��遰�����加�������������鮨����肋��琣���确��������蓿琣�蓿��������錸��疘������啦�������’���埘�����也��孕���������皃�����酽������ⅰ縧,�����������船�������、�����騯.���琱�����琣�����鴐������瑀������鵲、机��������.�、Ⅳ�������������、聃��鏼����羒����裞�����也��瓹���硕士学位论文:尖吻蝮蛇去整台素基因克隆与功能分析�����猧�����琤���.����疘��瑆�����,�������餺����.�������,����甌����“.����瓺�������、,��,���������������琧���璬������琲�����砒��������瓵�����