蝮蛇蛇毒中提取的一种具有激肽原酶活性的蛋白水解酶.doc

蝮蛇蛇毒中提取的一种具有激肽原酶活性的蛋白水解酶.doc蝮蛇蛇毒中提取的一种具有激肽原酶活性的蛋白水解酶
:张颖, 马骉, 刘利新, 邹毅, 罗云波
【摘要】目的: 从蛇毒中获得大量高纯度的具有激肽原酶活性的蛋白水解酶。方法: 采用离子交换和亲和层析技术进行纯化。结果: 从江浙蝮蛇毒中提取出了一种高纯度的具有激肽原酶活性的蛋白水解酶, 不需活化即可水解激肽原, 释放激肽, 并具有精氨酸酯酶活性。粗毒经提纯, 比活可达800 U/mg以上, 远远高于哺乳动物的激肽原酶, 纯度可达95%以上。对其性质考察, Mr为38 000, N-末端的15个氨基酸序列分析表明, 该酶与蛇毒丝氨酸蛋白酶及胰蛋白酶——激肽释放酶同源。结论: 这种方法适合于工业化生产。
【关键词】江浙蝮蛇蛇毒激肽原酶
自从有人在美洲矛头蝮蛇(Bothrops jararaca)蛇毒中发现激肽原酶后, 蛇毒激肽原酶越来越受到广大学者的重视[1]。我国蛇类资源丰富, 但受提纯工艺的限制, 至今仍未开发出蛇毒激肽原酶的药物制剂。我们采用离子交换和亲和层析技术, 从江浙蝮蛇(Agkistrodon halys pallas)蛇毒中提取了高纯度的激肽原酶, 并对其性质进行了研究。
1 材料和方法
材料江浙蝮蛇蛇毒冻干粉(辽宁省清源县), DEAE-sepharose , 琼脂糖凝胶(瑞典Pharmacia公司), 苯甲酰精氨酸乙酯(BAEE), 对甲苯磺酰精氨酸甲酯(TAME), 标准蛋白, 激肽原, 激肽等底物(Sigma公司), 低压型高效液相色谱仪(日本岛津公司), 8823B紫外检测仪(北京宾达英创科技有限公司), BALB/c小鼠(7周龄)由中国药品生物制品检定所实验动物中心提供。
方法
蛇毒激肽原酶的分离纯化(1)DEAE-Sepharose离子交换色谱: 称取江浙蝮蛇毒15 g, mol/L -HCl缓冲液溶解, 以4 000 r/min离心20 min, 取上清, 透析12 h后, mL/min的流速上阴离子交换柱(DEAE-Sepharose), mol/L -HCl缓冲液洗去未吸附的杂蛋白。(2)亲和色谱法: ①免疫抗体亲和层析柱的制备: 取少量离子交换色谱活性洗脱液, 用高效液相色谱法纯化并经定性得到蛇毒激肽原酶, 取该蛇毒激肽原酶50 μg与等体积完全佐剂混合乳化作为刺激物, 对7周龄的BALB/c小鼠皮下注射免疫, mL, 每周1次, 共免疫6次。在采集血清前3 mL刺激物小鼠尾静脉注射加强免疫。用抗原亲和层析柱纯化抗体。用溴化氰活化4B-Sepharose琼脂糖凝胶, 把得到的蛇毒激肽原酶抗体偶联到多糖基质上, 从而制成免疫亲和层析柱。
②亲和色谱法纯化蛇毒激肽原酶: 将经离子交换纯化的酶用平衡液透析, 上抗体亲和层析柱。用亲和层析洗脱液( mol/L Tris-HCl缓冲液, , mol/L NaCl, 70 g/L Arg)洗脱。收集洗脱峰, 冷冻干燥保存。(3)纯度检测: 取主峰组分适当稀释, 用高效液相色谱(HPLC)法检测。色谱条件: TSK-2000SE为底物测定[3]。③蛋白含量的测定: 采取凯氏定氮法测定蛋白质含量