二维色谱-质谱技术在蛋白质组学中的研究和应用.pdf

复旦大学
硕士学位论文
二维色谱-质谱技术在蛋白质组学中的研究和应用
姓名:王静
申请学位级别:硕士
专业:分析化学
指导教师:杨芃原
20040519
,强阳离子交换滓环聪滓在蛋白质组学研究中,目前采用的技术主要有二维凝胶电泳狿一质诺方法和多维色谱一质谱方法。随着全自动割胶、酶解、点样仪的出现,际踝远潭认喽蕴岣撸龇治鍪奔湟灿兴醵蹋进行了~些改进,如对电泳前生物样品进行预浓缩和预分离、分步提取以及对凝胶的染色过程进行优化,但均未有实质性的进展。发展高通量分析技术平台是蛋质谱技术是其中引人注目的技术平台之一。,优化蛋白的提取、酶解、前处理以及后继的二维分离条件和步骤,以求在本实验室建立一个适用于复杂蛋白质混合物分离分析的高通量平台。。考虑到酶解步骤在以及蛋白去折叠的影响,同时也讨论了蛋白还原烷基化的必要性和有效性。并且能力,对酶活性的影响远比。谒嵝蕴跫驴梢宰远到猓到馕镏不会影响后继的色谱分离,可以替代慈芙饽さ鞍住8萑芤好附獾奶氐悖结合现有的顺序提取蛋白的方法,:将提取步骤分为三步,第一步用水提取偏亲水性蛋白,第二步用含尿素和硫脲的溶液提取亲水性、中性和偏疏水性蛋白,第三步用去垢剂谱的实验条件进行优化,比较了流动相的值、有机溶剂的含量等因素对色谱分离的影响。根据优化实验条件的结果,以实验室现有的仪器装置为基础,建立了离线二维系统和在线二维系统。通过肌红蛋白的酶解肽段的分离鉴定,对离线二维系统中的反相上样时的传输溶液、组分收集时间以及在线系统中的进样盐浓度等一些参数进行了讨论。并且比较了在线和离线系统,离线系统灵活性比较强,是对于等电点极端的蛋白或膜蛋白仍无法达到很好的分离效果。近几年对该方法际踔械闹匾P裕紫壤帽曜嫉鞍桌纯疾旄髦值鞍妆湫苑椒ǘ悦富钚考察了新型去垢剂诘鞍酌附庵械挠τ茫隨相比,它具有很好的溶解鍿溶解剩余的不溶物质。第二部分主要是二维色谱一质谱系统的建立及应用。首先对强阳离子交换色可以分别优化每一维的实验条件,上样量不受第二维反相色谱的制约,能够富集低丰度肽段:在线系统整合性比较强,适合于少量样品的分离鉴定,而且对控制
纳滓撬鸷Ρ冉闲 W詈螅美胂叨低撤掷隓裸鼠肝肿瘤组凹钚苑段内均有蛋白被检出,蛋白数量也明显多于用—膜蛋白的歧视效应,织的水溶性蛋白,鉴定得到龅鞍鬃榉郑诖蠓肿臃段相对分子量,.技术鉴定出来的蛋白个数。另外,利用去垢剂芙夂煜赴さ鞍祝用在线二维系统分离鉴定出大量的膜蛋白,弥补了常规的二维凝胶一质谱技术对关键词:蛋白质组学、、蛋白酶解、蛋白提取、强阳离子交换色谱、离线二维系统、在线二维系统
..曲·曲,—瑃、—.狹——,——猟,甌瑃.,,—,.珹琣琲—瑃.,—,.
甌瑆琣—;篛母·,.;.,—.,.,.猦——,,—.:—籗.:琣琩,
第一章前言芯勘尘蛋白质组学概述传统的高通量蛋白分析手段——二维凝胶电泳一质谱至¨.蛋白质组一词是由坑暝谝獯罄鸖的一次电泳会议上首次提出,最早见诸于年碌摹癊”杂志上。,它是指基因组表达的全部蛋白质及其存在方式。蛋白质组学旨在阐明生物体全部蛋白质的表达模式及功能模式,其内容包括鉴定蛋白质的表达、存在方式奘涡问、结构、功能和相互作用等。蛋白质组的研究远比基因组复杂。一方面,蛋白质的数目远大于基因的数目,这是由于基因的拼接和翻译后的修饰造成。人的基因组有个编码基因浔泶锏牡鞍字士梢源锸竿蛏踔粮唷A硪环矫妫蚴窍喽跃蔡模一种生物体仅有一个基因组,而蛋白质是动态的,随着时间、空间的变化而变化,即使就是同一种细胞,它在不同时期、不同条件下,其蛋白质组也是在不断地改变之中,而且在病理或治疗过程中,细胞蛋自质的组成及其变化,与正常生理过程的也不同。一个细胞中的蛋白质可多达上万种,而它们的拷贝数可能相差几百倍到几十万倍。组成蛋白质的氨基酸有种,加上修饰的氨基酸就更多,而仅由趾塑账嶙槌伞4蛹际跏侄紊辖玻嗣俏薹ú捎迷诨蜓芯恐兴毡椴捎际趵词沟鞍字实玫嚼┰觯虼说鞍字首橹泻康偷牡鞍字试诖蠊婺5姆离鉴定中很难被检测到,而有些对细胞功能产生重大影响的蛋白质其表达量往往是比较低的。在基因组研究中,可以通过⒄罅屑际跏迪指咄康幕蛏选,而目前的蛋白质分析技术离工业规模的高通量还有较大差距。二维凝胶电泳—是目前唯一能将数千种蛋白质同时分离与展示的分离技术。是由疐和年分别提出的【.T校鞍字适紫雀莸鹊绲愕牟煌谝幌虻鹊缇劢沟泳中分离,接着被转移到二向郾┌纺荷希俑菹喽苑肿又柿看笮不同被分离。早期双向电泳中第一向用载体两性电解质产生梯度,使得重复性很差。世纪年代初期出现的固相化