[硕士论文]人真皮间充质干细胞的诱导、鉴定及初步应用.pdf

上海第二医科大学
博士学位论文
人真皮间充质干细胞的诱导、鉴定及初步应用
姓名:陈付国
申请学位级别:博士
专业:外科学(整形外科)
指导教师:曹谊林
20050501
堕一二⋯⋯⋯⋯禝————————————————●———!猒——!!!!!!!!猒———————————————一一一—,.【畇’痵猯
上海第二医科大学博士学位毕业论文疦’疦一——一
斌:查岱翊慨趔学位论文独创性声明学位论文使用授权声明本人究全了解上海第二医科大学有关保留、使用学位论文的规定,学校有阅。有权将学位论文的内容编入有关数据库进行检索。有权将学位论文的标题本人所呈交的学位论文是我在导师的指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知,除文中已经注明引用的内容外,本论文不包含其他个人已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体,均已在文中作了明确说明并表示谢意。权保留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文豹电子版和纸质版。有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论文迸入学校图书馆被查和摘要汇编出版。保密的学位论文在解密后适用本规定。作者签名学
⑨真皮间充质干细胞的诱导、鉴定与初步应用中文摘要其中是否存在三向克隆,从而揭示出其中的干细胞——真皮问充质干细胞。通过磁探寻易于取材与扩增的种予细胞是近年来组织工程研究的重点,骨髓基质于细胞便是其中的热点,但面临数量不足、造血干细胞损失等问题。位于人真皮层的成纤维样细胞数量众多、易于培养扩增,若其中含有干细胞,将为组织工程研究提供本研究旨在揭示人涑渲氏赴奶卣鳎ü芯科涓髦指上赴<细胞分选的方法初步分离多向分化潜能的细胞,并通过转基因技术将其改造为骨组在体外生长的基本属性,包括形态、生长曲线等;检测谋泶免疫细胞化学检测匝芯科涫欠窭丛从谥信卟恪M觳饧涑渲氏赴谋曛疚,,以下简称龋芯緿是否具有与间充质细胞不同的韵录虺艶懊庖呦赴Ъ测,研究间充质干细胞常见的表面标志物,以证实欠窬哂秀谐渲矢上上海第二医科大学博士学位毕业论文~种新的种子细胞来源。为此,本课题拟对人真皮成纤维样细胞笪募虺艱邢低逞芯浚越沂酒渲惺欠翊嬖诙嘞蚍只的间充质干细胞;运用磁细胞分选的方法初步尝试分离其中多向分化细胞,并通过基因修饰,进行体外成骨以及体内构建组织工程化骨。,在体外通过常用的成脂肪、成骨以及成软骨的诱导液进行诱导,以研究其是否具有多向分化的能力;通过对ハ赴寺〉姆治鲆约岸嘞蛴盏迹芯织工程的种子细胞,以达到体内构建骨组织的初步应用之目的。方法通过体外单层培养、觳獾确椒ǎ芯緿如,Ⅱ.平滑肌肌动蛋白韵录虺芐镒特征;同时以流式细胞术胞的初步特征。的诱导分化与检测通过成脂肪、成骨以及成软骨的诱导成分对的体外培养与鉴定目的
见其中含有少量的粜缘南赴庇蠬阳性的绌胞,这~特征与间杏盏迹⒁訰觳庀喙鼗虻谋泶铮灰杂秃烊旧ɡ刺匾煨缘检测脂肪细胞的存在;以’旧ḿ觳馊砉怯盏己笫欠翊嬖诘鞍锥嗵抢基质,以免疫组织化学方法检测型胶原是否存在;以检测碱性磷以旧ḿ觳獬晒怯盏己笫欠裥纬筛苹峤凇通过有限稀释法进行低密度接种,研究成脂肪、成骨以及成软骨的诱导,并以油红染色检测成脂肪克隆的存在;以觳釧,以觳飧苹峤诖佣笪某莆狢⒁訤检测其中粜韵赴拇慷龋阂普通成脂肪及成骨诱导液对疍进行体外诱导,亦证实其具有分化能力,且有作为骨组织工程种子细胞的可能;以本实验室构建的重组腺病毒研究其在体外的成骨能力。以组织化学、免疫组织化学、等多种方法证实其是否能够体外成骨后,将其与可吸收支架材料藻酸钠混合,注射到裸鼠股四头肌外的皮下组织内,体内生长周后分别进行猺结果在体外单层培养时呈现梭形、狭长形的成纤维样细胞的形态:体外能够长期培养与扩增:生长曲线的研究表明其第⒌趌约暗贘南赴仍然具有较好的生长动力学特征;诘南赴蠖嗍醋灾信卟悖铱上海第二医科大学博士学位毕业论文酸酶,以下简称在成骨诱导后的合成情况,并同时克隆的分析与鉴定的克隆形成能力,并进一步挑选出单细胞克隆,在体外进行适量扩增后,进行’旧ḿ觳獾鞍锥嗵恰⒁悦庖咦橹Ъ觳馄渲械腎徒涸佣认成软骨克隆的存在;以明成骨克隆的存在:最终综合分析以上所有指标,制定分级标准,研究其中二向克隆、双向克隆以及单向克隆的存在以及比例。魑W;蛟靥澹訡进行转基因改造,并进而检测、组织学及免疫组织化学检测,以揭示其是否具有体内成骨能力。在骨组织工程中的初步应片以7盅”曛荆捎么畔赴盅韵录虺芃方法,得到粜缘腄的以及
上海第二医科大学博士学位毕业论文充质来源的细胞接近;.、.跣裕庑┍砻姹曛疚锏谋泶锾卣饔氤<募涑渲矢上赴绕涫侵在体外进行多向诱导,检测成脂肪诱导后芸杉鸓埽J技觳獾紸虻谋泶铮琒’觳庀允后有较多的蛋白多糖类基质的合成;在进行微团块培养的同时进行软骨诱导型胶原。进行成脂肪、成骨以及成软骨诱导,经过多指标综合评价后知,个单细胞克分