电泳分离蛋白质.doc

电泳是一种分离蛋白质的常用手段。电泳中选择合适的缓冲系统十分重要。选择时主要考虑缓冲溶液的PH、离子种类和离子强度。一般分离酸性蛋白质的配制PH较大的缓冲溶液,分离碱性蛋白质的配制PH较小的缓冲溶液,而离子强度则尽可能小。试解释原因。
要点缓冲溶液PH 缓冲溶液离子强度
电泳的基本原理
带电颗粒在电场作用下,向着与其电性相反的电极移动,称为电泳(electrophoresis, EP)。利用带电粒子在电场中移动速度不同而达到分离的技术称为电泳技术。
生物大分子如蛋白质,核酸,多糖等大多都有阳离子和阴离子基团,,它们的静电荷取决于介质的H+,带电颗粒向阴极或阳极迁移,迁移的方向取决于它们带电的符号,这种迁移现象即所谓电泳.
缓冲溶液的PH与蛋白质的等电点有关
等电点(PI)
蛋白质分子的解离状态和解离程度受溶液的酸碱度影响。当溶液的PH达到一定数值时,蛋白质颗粒上正负电荷的数目相等,在电场中,蛋白质既不向阴极移动,也不向阳极移动,此时溶液的pH值称为此种蛋白质等电点。某一蛋白质的pI大小是特定的,与该蛋白质结构有关,而与环境pH无关。在某一pH溶液中当pH>pI时该蛋白质带负电荷。反之pH<pI时该蛋白质带正电荷。pH=pI时该蛋白质不带电荷。人体内pH=;而体内大部分蛋白质的 pI<6; 所以人体内大部分蛋白质带负电荷。不同蛋白质各有特异的等电点。最常用的方法是测其溶解度最低时的溶液pH值。
蛋白质是两性电解质,在蛋白质溶液中存在下列平衡:
电泳介质的pH值
溶液的pH值决定带电物质的解离程度,,氨基酸等类似两性电解质,pH值离等电点越远,粒子所带电荷越多,泳动速度越快,,当分离某一种混合物时,应选择一种能扩大各种蛋白质所带电荷量差别的pH值,,必须采用缓冲溶液.
离子强度
离子强度是表示溶液中电荷数量的一种量度。
离子强度等于溶液中各种离子的摩尔浓度与其价数平方之积总和的一半
I=1/2∑CiZi2 (I:离子强度;Ci:离子的摩尔浓度;Zi:离子价数. )
~
低离子强度时,迁移率快
但离子强度过低,缓冲液的缓冲容量小,不易维持pH恒定
高离子强度时,迁移率慢
这是由于带电的生物大分子吸附溶液中的反电荷离子形成离子氛