矽肺纤维化Egr-1活化信号转导途径及早期矽肺损伤蛋白质组分析.docx

矽肺纤维化Egr一1活化信号转导途径和早期矽肺损伤蛋白质组研究
摘 要
矽肺是最古老的职业病,主要以二氧化硅(silica dioxide,SiO:) 的吸入和沉积所引起的肺部炎症及纤维化病变为特征,严重危害人民的健康。虽然有关矽肺纤维化的研究已取得了一系列进展,但其发病的关键分子机制目前尚不清楚,因而至今仍未找到有效的治疗方法。截止96年底全国死于矽肺的就有6万人左右,而且近年来矽肺具有患病率增加快、患者年轻化的趋势,危害非常严重。因此从新的角度探索矽肺纤维化病变发生的分子机制,寻找有效的防治措施已成为迫切的需要。
目前研究发现细胞因子、生长因子、黏附分子等效应分子在矽肺纤维化病变的演进过程中起重要作用,但它们只是矽肺发生过程的一个重要环节,其上游和下游的分子调控机制目前仍不十分清楚。随着细胞信号转导研究地深入,发现核转录因子及其上游激酶在调节矽肺病变发生发展方面起着至关重要的作用。
核转录因子Egr—l(early growth response gene-1)为立早基因家族的一员。越来越多的研究表明其在肺部炎症纤维化疾病演进中扮演重要兔色。Egr一1通过调控转化生长因子B 1(transformation growth factor B 1,TGF B 1)、肿瘤坏死因子Ⅱ(tumor necrosis factor—Q,TNF—Q)等30多种基因表达而在调节细胞生长、分化、凋亡、炎性反应等方面发挥重要作用,而且参与调控细胞外基质(extracellular matrix,ECM)代谢,这些均提示核转录因子Egr-i 很可能参与矽肺纤维化病变的发生发展。值得一提的是在多数情况下 Egr—l的激活依赖于上游激酶丝裂原活化蛋白激酶(mitogenic
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activated protein kinase,MAPKs)的磷酸化,目前有少数研究提示 SiO。能诱导MAPKs的磷酸化,这意味着在矽肺纤维化发展过程中 Egr-1的活化也可能由磷酸化的MAPKs介导。
根据以上研究背景我们推测在矽肺纤维化发生发展过程中可能存在“SiO:一MAPKs--Egr一1一效应分子”信号转导途径。因而我们确定了矽肺纤维化Egr一1活化信号转导途径研究的课题,从核转录因子及上游激酶水平分别观察其活化与矽肺纤维化的关系,分别探讨活化的Egr一1及MAPKs在矽肺纤维化病变演进过程中的作用及二者的相互关系,进一步用蛋白质组学方法研究早期矽肺炎症病变中蛋白质表达的整体变化,筛选在矽肺纤维化发生早期起关键作用的靶蛋白分子。
首先,从整体水平(大鼠矽肺模型)研究核转录因子Egr-1及其下游基因TGF B 1、纤维粘连蛋白(fibronectin,FN)在矽肺中的表达变化,初步探讨接触SiO。后肺组织Egr一1表达及定位的变化及其与下游基因TGF B l、FN表达的相关性。结果显示在体内SiO。能活化 Egr一1转录表达,主要定位于肺巨噬细胞、肺泡上皮细胞等,活化的 Egr一1可能通过调控下游基因TGF B l表达而影响矽肺的发生发展。、II型肺泡上皮细胞的细胞模型。用细胞免疫荧光、蛋白印迹、 RT—PCR、凝胶迁移、报道质粒活性检测等方法研究SiO。刺激两种细胞后Egr一1定位、表达、转录及与特异DNA序列结合活性的变化;研究发现Si -1迅速发生核转位, 蛋白表达及转录均明显增加,且核蛋白DNA特异结合活性亦明显升高。
进一步用免疫组化及蛋白印迹法检测染尘大鼠肺组织及SiO:、定位。并用激酶活性检测法研究了SiO。处理后两种细胞ERKl/2活性变化。进而用特
异的激酶抑制剂,观察阻断后Egr—l转录及其核蛋白表达变化,探讨 Egr一1活化是否依赖于磷酸化的MAPKs。结果显示在体内SiOz能活化 ERKl/2、p38,主要定位于肺泡上皮细胞、肺泡巨噬细胞及支气管上皮细胞等。体外SiO,、h549细胞中ERKl/2、p38 迅速活化,ERKl/2活性迅速升高;且磷酸化的ERKl/2、p38介导Egr一1 的活化。另外两种激酶同时阻断并不能完全消除Egr一1的活化,提示还可能有其它激酶参与此信号途径。
最后用蛋白质组学方法研究早期矽肺组织整体蛋白表达变化,比较矽肺组织与对照肺组织蛋白二维凝胶电泳(two dimensional electrophoresiS,2-DE)图像发现:二者蛋白质点大部分分布在pH4—8
Mr20—70范围内,而在pH3-, 而在pH6—8蛋白质点的分布正好相反。用