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目录应用PCR技术诊断猪伪狂犬病一、立题依据二、研究的主要内容及预期目标三、研究材料及实验步骤四、实验进度安排五、主要参考文献◆立题依据1、关于猪伪狂犬病背景知识:猪伪狂犬病(Pseudorabies,PS)是由伪狂犬病病(Pseudorabiesirus,PRV)引起的一种高度接触性的急性传染病,以发热、脑脊髓炎为主要症状。猪伪狂犬病毒具有长期潜伏感染、终生带毒的特性。猪是本病的主要宿主和传染源,健康猪与病猪、带毒猪直接接触可感染此病。该病被国际兽疫局列为二类传染病。感染猪的临床特征为体温升高,新生仔猪出现腹泻、呼吸困难、肌肉震颤并继发麻痹、共济失调等神经症状,感染率和死亡率可达100%;成年猪常为隐性感染,且长期带毒排毒,成为最危险的传染源,严重影响养猪业的发展。◆立题依据2、病原学研究:伪狂犬病毒属于疱疹病毒科,α疱疹病毒亚科,猪疱疹毒Ⅰ型,完整病毒粒子呈圆形,直径为150~180nm,核衣壳呈二十面体对称,直径为105~110nm,有囊膜,囊膜表面有长约8nm~10nm呈放射状排列的纤突,PRV的毒力由几种基因协同控制,主要有gE、gD、gI、和TK基因,其中TK基因是主要的毒力基因。PRV对外界环境的抵抗力较强,55℃50min、80℃3min或100℃瞬间才能将病毒杀灭。PRV只有一个血清型,但毒株间存在差异。病毒能在鸡胚及多种动物细胞培养上生长繁殖,产生核内包涵体。实验动物也可用于病毒的分离。病毒对外界抵抗力较强,在污染的猪舍能存活一个多月,在肉中可存活1周以上。一般常用的消毒剂对其都有效。◆、呼吸困难、肌肉震颤并继发麻痹、共济失调等神经症状。表现为妊娠流产、木乃伊胎、死胎、产弱仔及呼吸系统临诊症状;长期带毒排毒。常为隐性感染。主要表现繁殖障碍和呼吸系统临诊症状;长期带毒排毒。3、感染猪只临床特征:◆立题依据4、危害:全世界:目前已有50多个国家和地区报道该病的流行。中国:自1947年首次报道该病以来,已有20多个省市报道发生了该病。全世界每年因伪狂犬病造成的经济损失多达数十亿美元,目前,该病已成为全球危害养猪业最严重的传染病之一,引起看世界各国的高度重视。◆、现有诊断技术及分析:常规检测方法常常存在特异性差、敏感性差、操作技术复杂、费时费力等缺点。PCR方法具有快速、特异、敏感、重复性好的特点。◆立题依据综述,随着养猪业集约化规模化的发展,猪伪狂犬病不断蔓延和扩大,危害越发严重。目前,该病已成为全球危害养猪业最严重的传染病之一,引起世界各国的高度重视。现阶段,国内外预防PR主要采取隔离、免疫、淘汰猪群中隐性感染猪和预防接种,因此对该病的及早确诊显得尤为重要。本实验拟开展应用PCR技术诊断猪伪狂犬病的研究,对该病的准确诊断和针对性防控提供实验室依据!研究的主要内容及预期目标1、研究主要内容:临床疑似猪伪狂犬病的病例的诊断与收集。通过PCR技术对疑似猪伪狂犬病病料进行检测。2、预期目标:掌握PCR诊断猪伪狂犬病的实验方法,对四川猪场送检的疑似伪狂犬病病猪进行确诊。研究材料及实验步骤1、研究材料::标准毒株PRV闽A株。:通过对四川省内养殖场送检的临床疑似猪伪狂犬病病猪采样获取。:TaqDNA聚合酶、蛋白酶K、dNTPs。:冷冻高速离心机、PCR反应系统、组织研磨器、电泳仪、凝胶成像系统。研究材料及实验步骤2、:通过离心、电泳等操作提取样本DNA。:PCR反应体系为30ul,,200umol/LdNTPs,,10mmol/LTris-HCl(),,1ul模板DNA。反应步骤参照PCR反应程序(如图)。:PCR扩增产物10g/L琼脂糖凝胶上电泳,EB染色,在紫外灯下观察PCR产物在凝胶上的位置。