猪戊型肝炎检疫技术规范.doc

猪戊型肝炎检疫技术规范.docICS点击此处添加ICS号点击此处添加中国标准文献分类号SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准XX/TXXXXX—XXXX猪戊型肝炎检疫技术规范QuarantineprotocolforswinehepatitisEvirus(本稿完成日期:)XXXX-XX-XX发布XXXX-XX-XX实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布前言本标准按照GB/-2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位:中华人民共和国广东出入境检验检疫局、中华人民共和国北京出入境检验检疫局、中华人民共和国上海出入境检验检疫局、上海市动物疫病预防控治中心、中国农业科学院兰州兽医研究所。本标准主要起草人:鱼海琼、乔彩霞、张强、林志雄、罗长保、赵吟、刘佩红、兰喜、周锦萍、柳纪省、李树清、蔡先全猪戊型肝炎检疫技术规范范围本标准规定了猪戊型肝炎的临床诊断、酶联免疫吸附试验、实时聚合酶链式反应和环介导等温扩增等检疫技术。本标准适用猪戊型肝炎的诊断和检疫。规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T18088出入境动物检疫采样缩略语HEV戊型肝炎病毒BSA牛血清白蛋白HRP辣根过氧化物酶OD值光密度值ELISA酶联免疫吸附试验荧光RT-PCR实时荧光聚合酶链式反应LAMP环介导等温扩增试剂HEV阳性对照血清。HEV阴性对照血清。HRP标记的HEV抗原。HEV抗原包被板牛血清白蛋白。辣根过氧化物酶标记的兔抗猪IgG。()抗原稀释液()洗涤液()吐温-20。封闭液()。显色剂A和B()。终止液()。酶稀释液()。TRIZOL。三氯甲烷。异丙醇:-20℃预冷。%DEPC水()。75%乙醇。RNA酶抑制剂(40U/μL);TaqDNA聚合酶及相应10×缓冲液;M-MLV反转录酶(200U/μL)及相应5×反转录反应缓冲液;设备与材料恒温培养箱。二氧化碳培养箱。二级生物安全柜。高压灭菌锅。微量移液器。酶标仪。酶标板。洗板机。高速冷冻离心机。电热恒温水槽。荧光PCR仪。水平凝胶电泳槽。电泳仪。凝胶成像系统。临床诊断流行病学戊型肝炎的流行病学特点与甲肝相似,。临床症状及病理变化猪自身感染HEV临床症状并不明显,。初步诊断根据临床症状、病理变化和流行病学可以作出初步判断,进一步诊断应采集样品进行实验室检测,该病原属人畜共患病,涉及病原的检测应在生物安全实验室进行,样品保存和废弃物处理应按照生物安全要求进行。实验室检测酶联免疫吸附试验(间接ELISA)原理96孔微量板的奇数孔包被有戊型肝炎病毒基因III型衣壳蛋白重组抗原,偶数孔未包被。检测样品和对照样品加入到反应孔内,每个样至少加平行的两孔,如果存在抗体,会形成抗原-抗体复合物。洗板后,加入HRP标记的酶结合物,该酶标结合物与HEV抗体结合,形成抗原-抗体-酶复合物。洗去过剩的酶结合物,加入底物液,样品中特异性抗体的数量就会在奇数、偶数孔间出现颜色差异:如果存在抗体,加入终止液后蓝色液体会变成黄色。如果没有抗体,则无色。操作步骤本标准推荐采用法国IDVETIDVET方法是由法国试剂盒生产公司提供的方法,给出这一信息是为了方便本标准的使用者,并不表示对该产品的唯一认同,如果其它等效产品具有相同的效果,则可使用这些等效产品。方法进行。使用前将所有试剂平衡至室温(21±5)℃,将反应板/条做好标记,阴性对照孔A1,A2,B1,B2,阳性对照孔C1,C2,D1,D2,10倍稀释样品稀释液。用多通道移液器加190μL样品稀释液至所有样品孔。加10μL阴性对照至A1,A2,B1,B2孔;加10μL阳性对照至C1,C2,D1,D2孔;加10μL检测样品到其他剩余的孔,各加两孔,微量振荡器混匀。密封微量反应板,室温(21±5)℃反应(45±4)min。用300μL/孔洗液洗板3次,最后一次拍干以去除残留洗液。将酶标记抗原用酶稀释液10倍稀释后,加100μL至所有样品孔,微量振荡器混匀。密封微量反应板,室温(21±5)℃反应(30±3)min。同上洗板。加100μL底物液至所有样品孔。密封微量反应板,室温(21±5)℃避光反应(15±2)min至颜色变化。加100μL终止液至所有孔终止反应,终止液添加顺序与底物溶液添加顺序相同。振荡混匀,用酶标仪在450nm条件下读取OD值,15min内完成结果读取。OD=OD奇数孔-OD偶数孔有效性判断当下列条件成