[优秀论文]幽门螺杆菌外膜蛋白OipA基因在胃粘膜上皮细胞产生白介素-8中的作用.pdf

上海第二医科大学
博士学位论文
幽门螺杆菌外膜蛋白OipA基因在胃粘膜上皮细胞产生白介素-
8中的作用
姓名:陆红
申请学位级别:博士
专业:内科学消化专业
指导教师:刘文忠;萧树东

豳门螺秆菡终膜蛋自基因在胃粘膜上皮细胞产生自介素一械淖饔染辏栽粗刈楹笤诼让顾匮≡裥耘嘌刑粞⊙粜钥寺。艟博士骈究生刘文忠萧树东教授中文攘要第一部分幽门螺杆菌外麒蛋白背景:熬门螺凝薹毒力基嚣的礤究有驹子麓噢酝门螺拇蘩麴致痰撬铡。基因剔除怒研究单个基潮功能的重要方法。全基因替代方法被认为能够最低限度地减少目的基因剔除所学致的下游基因产生极性效应而丧失全部戏部分功能,避免传统捶入法截躲部分綦强产生菜些功§§对实验造成瓣于撬。方法:本研究用全基围替代方法构建幽门螺杆菌外膜蛋白全基因剔除菌株。柿5墓菇ǎ撼樘嵯妇鶫染色体杓埔镒鱌获得以及楣邻鼹铡基毽鼿终豹片龌;将该丫郝∪质粒嘏I杓埔镆倍稀释的上述含克隆片断的璜糨为模板再作反向竦么笮≡钠希闷虾兄柿R约澳康幕虻南嗔诹讲嗷颍不含,虽其两旗禽隈制性内切瓣奈坏恪8贸て尉Ⅱ祝氪髅素相连接,经大肠杆菌转染和氨苄青霉索和氯霉素筛选获得阳性克隆。少量抽提该质粒,经椒ā⑾拗菩阅谇忻负筒庑蚣ê螅诖蟪Ω司写罅扩增纯化莠接提该质歉。H境鰂问爿觯涸芨貌缓琽恼鹆Q烊蛔H次纯化后大量扩增。畂槐渲甑捏蓝ǎ撼樘嵬槐渚耆旧錎和菌体蛋臼,用椒ㄖ擅庖哂≈鸱旨屑ā结采:椒ê兔庖哂″戏治鱿允荆簅槐溟琽鞍状列裕涮匾祧嗽残结论:成功获褥剔除基因斡幽螺授萤突变撩,为进一步獗究打下基戳。幽门螺杆菌外膜蛋白在讶粘膜上皮细胞产黑鱼坌茎:盟堡筮黼红指导教师全基因剔除菌株的建立列缺失。、
羚簇器南酗程褥糖簇上瘦缁赡产生自余豢一腺∫时,槐渲甓韵赴舾轿廾飨韵陆担鴋槐渲旰蚳痮繁黧帮分背景:外膜炎性蛋白是新发现的一种幽门螺杆菌炎症相关基因,根据冀端二核瞢酸重复数的滑链机制分成有功能的开放状态帮无功能的关闭状态。自介素一情阥莞崖囱尊娣从χ绣5难仔愿侔蜃印?—甤化举趋化因子的产生。本研究目的在于探讨方法:使用人胃癌细胞株痛尤毡疚秆谆颊叻掷氤龅挠拿怕莞司为秘珽法检测不同时闻细胞培养上清申一乃浒姿健S肦方法检测不溺时闻绥骢培养上清中一平。ü馑孛副ǜ嬷柿转染入臀癌细胞株琑荧光素酶报爨质粒甌治鲎H拘у海,畃樟糜诒小时,以毅裰荧光素酶试裁盒测定荧光素L潜缡匝椋篗为强时,突变撩帮突交株对绥藏糙辩鸹受下降,爨自裁激试验:猯裕厣;鲋暝小时时菲常显麓,在小时时达平台期。突变株和/与无阴性对照组类似。突变株产生较慢且平台期延迟至小时,均显著低予野生型菌株。而突变株甀刺激试验:猯保吧途曜饔檬奔湮.∈保小增加。悴欠裼肫涠晕赴┫肝踔甑恼掣阶饔糜泄兀约皁訧白B及其、、、/和/等位然因的幽螺枰萤突变拣。黩门骡秆菌对鲴匏藉辩试验采雳倬胂覆乇鹊分鄹为、。抗畃固錶:作为一抗,魑N詹ǔぁ隚魄德送行半定囊双突变株约下降%。时,均无明鼹改变。在平台裁诱导一拔∮肴⑸丝肺薏罹恕为玻琽唤涣貌蛋囱明显低于野生型菌株,但达到平台期的时间未见延迟。幽门螺杆菌外膜蛋白在胃粘膜上皮细胞产擞自介素中的熙用调节的环节。酶的表达。结果:
幽门蠕杆藏井旗蛋白在臀粘膜上皮细胞整垒坌童:塑堡望时时达餮嵩漳,突变椿仅在〗嗔娇山γ芟倭浚琧痮槐浼鹪丽突变株俸搿时闻为∈保小时时达到高蟑。,在∈笔贝锏礁叻澹鴒槐渲曜饔贸中小时,在∈笔贝锏缴谭澹启动子调控区域基因荧光素酶报告基因分析岷衔坏悖琁橘诺闳笔Ь野生型菌株和突变橡诱导表达量较刺激一/鸬野生型莹攘、突变拣帮突变撩静诱导表达量较刺激野生鍪菌株和突变株露一/鸬挠盏急泶锞髡障陆担渲蠳使细菌诱导的报告蕊因表达完全受到抑制。突变株刺激—样突变~/鲆鸬挠盏急泶镂廾飨愿谋洹整个时段内几无测出。突变株作用时间为∈保小时时达到高峰。下降亦非常迅速。完整照动子掇告基因一/突变株和/双突变株内诱导报告基因的表达鬣极低。突变檬与野生型骜拣提比无最著差髯。。。鐰猯结合位点/所有菌株均不能引怒诱导表达。和祥突变槐涓—槐洹/一疞丽引越的诱导表达均明显下降,丽刺激含一狪禢狵含—积曲缺失—~一/一/一疞甀
些堕型型璺墅塑墅美璺暨塑崖壁坠宜芡篌弥羡腥童鉴篷望缩论:突变所致的一档褪莖冶旧硪鸬模匾煨缘模胝掣轿关,这郡与典型的钤膜爱囊不恩。突变株帮突变株越的~水平升高傻子其野生型,突变株诱导的一较陆捣浅Q杆佟鏖动予调控区域基耀荧光素酶报告基因分析显示,—和样元件避幽门螺杆菌诱导一蜃B妓匦氲摹<婕皁盏嫉奶匾欤毖门螺杆莹;