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RNA干扰(RNAi)实验原理与方法
近年来的研究表明,将与mRNA对应的正义RNA和反义RNA组成的双链RNA(dsRNA)导入细胞,可以使mRNA发生特异性的降解,导致其相应的基因沉默。这种转录后基因沉默机制(post-transcriptional gene silencing, PTGS)被称为RNA干扰(RNAi)。一、RNAi的分子机制K7TzF&  
通过生化和遗传学研究表明,RNA干扰包括起始阶段和效应阶段(inititation and effector steps)。在起始阶段,加入的小分子RNA被切割为21-23核苷酸长的小分子干扰RNA片段(small interfering RNAs, siRNAs)。证据表明;一个称为Dicer的酶,是RNase III家族中特异识别双链RNA的一员,它能以一种ATP依赖的方式逐步切割由外源导入或者由转基因,病毒感染等各种方式引入的双链RNA,切割将RNA降解为19-21bp的双链RNAs(siRNAs),每个片段的3’端都有2个碱基突出。 i?@M  
在RNAi效应阶段,siRNA双链结合一个核酶复合物从而形成所谓RNA诱导沉默复合物(RNA-induced plex, RISC)。激活RISC需要一个ATP依赖的将小分子RNA解双链的过程。激活的RISC通过碱基配对定位到同源mRNA转录本上,并在距离 siRNA3’端12个碱基的位置切割mRNA。尽管切割的确切机制尚不明了,但每个RISC都包含一个siRNA和一个不同于Dicer的RNA酶。 Fz q41jiS  
另外,还有研究证明含有启动子区的dsRNA在植物体内同样被切割成21-23nt长的片段,这种dsRNA可使内源相应的DNA序列甲基化,从而使启动子失去功能,使其下游基因沉默. JgRYljQi2  
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 二、如何进行RNAi试验 is^pgKX  
\6I +K (一)siRNA的设计 wEW4gz{s  
1. 在设计RNAi实验时,可以先在以下网站进行目标序列的筛选: x*XH]&V  
iness/products/ nR;D#"
p%  
hlib/misc/ Mz]: }qmFA  
.edu/Stu/shilin/ $4SzUZ0  
http://design./rnadesign/?SID=45358710 lK7m=[ j  
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(1)从转录本(mRNA)的AUG起始密码开始,寻找“AA”二连序列,并记下其3'端的19个碱基序列,作为潜在的siRNA靶位点。有研究结果显示GC含量在45%—55%左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更为有效。
***@UBjq%z  
Tuschl等建议在设计siRNA时不要针对5'