IMP-3N端结构域重组腺病毒载体的构建与鉴定.docx

南京医科大学硕士学位论文
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作者签名:聋互j磊 导师签名: 日期:趟车姐』目
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南京医科大学硕士学位论文
T I MP-3 N端结构域重组腺病毒载体的构建与鉴定
中文摘要
目的组织金属蛋白酶抑制因子一3(tissue inhibitor of metalloproteinase一3, )在胰腺癌的发生和发展中起着重要的作用。但是, N端结构域()蛋白对胰腺癌的作用还不清楚。本课题拟构建与鉴定 N—TIMP3重组腺病毒载体,。另外,还拟构建与鉴定增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)重组腺病毒载体,作为重组腺病毒载体构建过程中的系统阳性对照。
方法分别将编码N-TIMP3与EGFP的DNA片段定向克隆至穿梭质粒 pShuttle-CMV,构建重组穿梭质粒pShuttle-—EGFP。
将上述穿梭质粒Pme I线性化后,
重组,构建重组腺病毒载体pAd-N—TIMP3与pAd-EGFP。分别将Pac I 线性化的重组腺病毒载体转柒QBI一293A细胞,获得重组腺病毒 Ad-N。TIMP3与Ad—EGFP。,用半数组织培养感染剂量(tissue culture infectious dose 50, TCID50)法检测滴度。最后,将重组腺病毒Ad--,通过Western blot的方法检测 N端结构域蛋白的表达,以及通过荧光倒置显微镜检测绿色荧光蛋白的表达。
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-}5 pShuttle—EGFP经过鉴定,被确认成功构建;相应的重组腺病毒载44vpAd--,也被确认成功同源重组。,能够观察到细胞致病变效应(cytopathic effect,CPE).重组腺病毒Ad—N-TIMP3 ,滴度分别达至I]5x108PFU/ml与8x108PFU/ml。最后,将重组腺病毒Ad- PANC一1细胞,能够检测到目的蛋白的表达。-TIMP3-与 (后者为系统阳性对照),并检测到目的蛋白的表达,,。
()N端结构域; 增强型绿色荧光蛋白(EGFP);腺病毒载体
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Lonstruction and identincation ol binant adenoviral
plasmid expressing the N--terminal domain of TIMP--3
Abstract
objective TIM])一3(tissue inhibitor of metalloproteinase一3)plays an important role in the development of pancreatic ,the effect of N—TIMP3 (N—terminal domain of TIMP一3)on pancreatic cancer is still not aim of this study was to construct and ident