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猪血液的实验室检测及数据分析技术
农业部种猪质量监督检验测试中心(广州)刘建营曹长仁谢水华樊福好*
前言
血液学的检测技术在当前的养猪生产中已经显得越来越重要。为指导养猪生产提供更加科学的依据,为疫苗接种提供更加准确的评价标准,为饲养管理方式的采用和变更提供更加详实的数据,实验室检测结果的判定和数据分析技术越来越受到广大科技工作者和养猪生产者的关注,本文拟对此进行简述,以期抛砖引玉。
1、血液样本的采集
猪的血液采集部位一般选择在耳静脉、颈静脉和前腔静脉进行。耳静脉采血虽然方便,但采血量不足;颈静脉和前腔静脉对采血的技术要求较高,一般难以掌握,但一旦掌握技巧,采血的速度将非常迅速,常在几秒钟内即可完成。
过去采血一般使用注射器直接采集,但采集的血液容易受到污染,容易导致红细胞破裂和出现脂血的问题,大大地影响检测结果。
建议采用血液保护液进行采血,具体步骤是:用注射器采集血液保护液约2毫升,然后采集血液约2毫升,轻度混匀。此时采集的血液上清为无色状态而非淡黄色状态,这些血液样本大大利于进行ELISA、PCR和血液生理生化的检测。
在进行血液检测工作之前,首先要确定采集的样本量。按照生物统计学的原理,应该采用分层采样的方法。即首先确定一个类别群体,比如公猪群、经产母猪群、哺乳仔猪群、保育猪群、生长猪群,等等。
通过抽样确定总体样本的属性,要考虑检测误差、检测结果的估计标准差和置信区间来确定样本量,如在猪瘟抗体检测中,容许误差为5,标准差为15,置信区间取95%,根据N=(*标准差/误差)2,则样本量为35。即:容许误差越小,估计标准差越大,置信区间越大,所需样本量越大。
根据经验,按照现行市面上通用的检测试剂盒的特异性和敏感性以及检测结果的估计标准差计算,每个群体(即采样层)需要采集样本约30份左右为宜。采样时,必须遵循随机抽样的原则。
2、抗体检测及数据分析
在过去的曾经一段时间内,猪血液中的抗体检测一直采用间接血凝试验(如猪瘟抗体的检测),但该方法操作繁杂,误差较大,已经被大多数实验室所弃用;而市面上的免疫金试验由于误差较大,不能量化,结果不可信,推广难度就显得较大。目前大多数实验室采用的检测抗体的方式是酶联免疫吸附试验(简称ELISA),该方法操作规范,结果可靠,数据可通过计算机存储并便于分析。在进行ELISA检测时,要注意的几个事项是:孵育温度要准确、洗板力度要适宜、阴阳性对照均需要分别设立至少两份以上(很多实验室采用一孔进行阴性或阳性对照来节省检测成本的做法是不推荐的),采用保护液采集的血液样本要换算稀释倍数。
通过ELISA方法检测获得的抗体结果分为三种:阳性、阴性和可疑(某些试剂盒未
设置可疑结果)。由于这三种结果在本质上是完全不同的,在分析结果时要分类计算,不可混合分析。比如:
阳性率=阳性结果数/检测样本总数。
平均值=阳性结果总和/阳性结果样本总数(而非总样本数)。
阴性结果无论数值大小,均应归至某一定值:如在猪瘟的抗体检测中,阻断率大于40为阳性,30-40之间为可疑,30以下为阴性。假定某三个样本的检测结果分别为20、20、5,则这三个结果均应归为0,因为20、20和5的意义和0是相同的,他们之间并不存在抗体含量数值上的差异。即这三个样本的抗体平均值为0,而不是[(20+20+5)