蛋白酶活性的测定方法(GB/T23527-2009)
1 原理
蛋白酶对酪蛋白、乳清蛋白、谷物蛋白等都有很好的水解作用。磷钨酸和磷钼酸混合试剂,即福林-酚试剂,碱性条件下极不稳定,易被酚类化合物还原而呈蓝色反应(钨兰和钨兰混合物)。由于蛋白质中含有具有酚基的氨基酸(酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸),因此,蛋白质及其水解产物也呈此反应。利用蛋白酶分解酪素(底物)生成含酚基氨基酸的呈色反应,来间接测定蛋白酶的活力。
2 仪器和设备
分析天平:
恒温水浴:精度±℃
计时表
分光光度计
沸水浴器
振荡混合器
pH计:
3 试剂和溶液
乳酸缓冲液(pH=)适用于酸性蛋白酶
甲液:称取乳酸(80%-90%),加水溶解并定容至1000ml。
乙液:称取乳酸钠(70%)16g,加水溶解并定容至1000ml.
使用溶液:取甲液8ml,加乙液1ml,摇匀,稀释一倍,。
磷酸缓冲液的制备(pH=)适用于中性蛋白酶
准确称取磷酸氢二钠()(),加水定容至1000ml
硼酸缓冲液(pH=) 适用于碱性蛋白酶
甲液:,加水溶解并定容至1000ml。
乙液: ,加水溶解并定容至1000ml.
使用溶液:取甲液500ml,加乙液400ml,摇匀,用水稀释至1L。
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,以蒸馏水溶解定溶至1000ml.
:
,以蒸馏水溶解定溶至1000ml
:
准确称取2g NaOH溶解并定至100ml
,,(若为酸性蛋白酶则用浓乳酸2-3滴)润湿,,加入适量的各适宜的缓冲液约80ml,在沸水浴中边加热边搅拌,直至完全溶解,冷却后,转入100ml容量瓶中,用适宜的缓冲液稀释至刻度,此溶液在冰箱内贮存,有效期为三天.
100μg/ml酪氨酸标准溶液
准确称取预先于105℃干燥至恒重的L- ,用1mol/L的盐酸60ml 溶解后定容至100ml,.
,, L-酪氨酸标准溶液.
酶样的制备
,用少量的适宜缓冲液溶解并用玻璃棒捣研,然后将上清液倒入100ml容量瓶,沉渣中再添入少量缓冲液捣研多次,最后全部移入容量瓶,稀释到刻度,用四层纱布过滤。。
4 分析步骤
标准曲线的绘制
L-酪氨酸标准溶液按下表配制。
试管号
0
1
2
3
4
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