Clontech-Lenti-X™-1慢病毒包装操作说明用Lenti-XHTXPackagingSystem生产慢病毒悬浮物为了获得最高效价的病毒悬液,用Lenti-X293T细胞系,严格尊守以下说明,尤其尊守(1)培养体系和培养量(2)DNA的量和转染质量(3)无四环素血清(4)孵育时间。所有的Xfect™转染成份,量和条件最好用Lenti-XVectors,Lenti-XHTX包装混合物,Lenti-X293T细胞。用10cm组织培养板并确保血清无四环素,四环素污染的血清对表达包装成份是有害的。所有的实验步骤均在无菌组织培养器血中完成。包装病毒需要有微生物安全等级2的生物安全柜中进行,注意重组的假性慢病毒包装颗粒能够感染人。转染24小时前,在10cm培养板接种4-5×106个293T细胞,添加10ml的生长培养基。在37℃,5%CO2℃条件下过夜。在进行第7步前确保培养血有80-90%的覆盖率。充分混均XfectPolymer。每个转染样品需准备两个离心管,按顺序添加如下试剂Tube1(PlasmidDNA)Tube2(Polymer)557µµlXfectReactionBuffer36µlLenti-µlXfectPolymer7µlLenti-XVectorDNA(1µg/µl)600µl总量600µl总量注意:XfectPolymer不要在室温下搁置长于30min充分混均每个管把Tube2添加到Tube1中,中速涡旋10秒。在室混下孵育DNA-Xfect混合物10min,这时可形成纳米复合物。把1200µl的DNA-Xfect溶液(第5步制备)加入到第1步准备好的细胞中,前后左右轻轻晃动培养血,使其均匀。在37℃条件下培养。4小时或过夜后,换10ml的完全生长培养基,在37℃条件下在培养24-48h。病毒滴定量在48h后可达到最高。注意:移弃的培养液包含了可感染的慢病毒。吸取慢病毒悬液。在500g下离心10min。注意:悬浮液包含可感染的慢病毒。用Lenti-XGoStixTM鉴定病毒产物或者滴定病毒株。然后可用病毒产物转导靶细胞。也可在-8
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