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pET System Manual
第版系统操作手册于年月修订完成。一直致力于研制开发系统,并将系统的新进展
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内容提要
内容提要 1
I. 系统介绍 4
A. 概况 4
B. 使用许可及协议 4
C. 系统组成 4
D. 选择合适的 pET 载体 4
基本考虑因素 5
蛋白溶解性及细胞定位 5
融合标签 5
各种 pET 载体特性列表 7
E. pET 载体克隆策略 8
制备不带融合标签的天然蛋白 8
制备以蛋白酶切去融合标签的天然蛋白 9
不需连接反应的克隆方法(LIC) 9
F. pET 系统蛋白表达的调控 10
T7lac启动子 10
pLysS 和 pLysE宿主菌 10
载体与宿主菌共同影响表达水平 10
含葡萄糖的培养基 11
pLacI 宿主菌 11
pETcoco™系统 11
G. 用于克隆的宿主菌 11
H. 用于表达的宿主菌 12
蛋白酶缺陷型 12
调节培养体系中所有细胞的表达水平 12
二硫键的形成及增加蛋白可溶性 12
补充稀有密码子 13
硒代甲硫氨酸标记 13
pET 系统各种宿主菌特性列表 14
I. 抗生素抗性 16
J. CE6 噬菌体 16
K. 诱导对照 17
II. 建立原核表达体系的基本知识 18
A. pET 系统操作流程 18
B. 生长培养基 19
C. 菌株保存 20
D. 制备载体 21
E. 制备插入片段 22
III. 目的片段克隆 23
A. 连接反应 23
B. 转化 23
操作小诀窍 23
操作步骤 24
铺板技术 25
操作手册 TB055 第 10 版 1
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C. pET 重组子分析 25
用 EcoPro™系统分析转录/翻译水平 26
质粒模板 26
PCR 模板 26
转录/翻译分析的连接 PCR 28
转录/翻译分析的菌落 PCR 29
菌落筛选 29
质粒制备 30
测序 30
IV. 表达目的基因 30
A. 转化表达用宿主菌株 31
B. DE3溶原菌的诱导 31
诱导的准备工作 31
诱导的操作步骤 31
V. 优化表达条件 32
A. 增加蛋白溶解性及折叠 32
温度 31
裂解缓冲液 32
细胞周质定位 32
细胞质定位 33
宿主菌 33
B. 稀有密码子 34
C. 毒性基因及质粒不稳定性 33
氨苄青霉素的使用 35
补充葡萄糖 35
质粒稳定性测试 34
稳定甘油菌株保存过程中氨苄抗性 pET 载体上的毒性基因的措施 35
稳定诱导过程中氨苄抗性 pET 载体上的毒性基因的措施 35
D. 影响表达的其它因素 36
N-端原则 36
二级翻译起始位点 36
mRNA 转录产物中的二级结构 37
意外终止密码子 37
转录终止子 37
不稳定的目的 mRNA及蛋白 37
VI. 目的蛋白分析 38
SDS-PAGE电泳上样体积标准化 38
生长和诱导 38
诱导培养物的光密度分析 38
A. 用 PopCulture™快速分析蛋白表达水平、活性及可溶性 39
B. 细胞总蛋白组分 39
C. 培养基组分 39
D. 细胞周质组分 40
E. 细胞质可溶部分组分 41
BugBuster® 和 Benzonase® 核酸酶处理 41
rLysozyme™溶液和冻融处理 42
机械破碎 43
F. 细胞质不溶部分组分 43
BugBuster®试剂处理后的包涵体纯化 43
机械性裂解细胞的包涵体纯化 43
G. 用 PopCulture™试剂制备抽提物 44
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