暑期实习感言吉林农业大学生命科学学院生物技术三班吕悦实习感言在这次实习中我们收获颇多,因为我不仅学到了知识,也学到了技术。在这里我感到了快乐与成就,还有朋友的重要性。实习中我们得到了很多技术。流程巢式PCR,或正式PCR。胶回收技术,得完整片段。酶切片段,目的基因与载体同时切。连接,转化。PCR验证,得阳性结果。摇匀,提质粒。PCR酶切,用3步中的酶验证。测序。载体构建。PCR的反应步骤:变性-退火-,000g4℃离心5分钟,.12,000g4℃,000g4℃离心10分钟向沉淀中加入1ml的75%,000g4℃),按以下顺序。1)模板总RNA10ng-5ng或poly(a)RNA1ng--)引物oligo(dt)(100pmol)(100pmol)基因特异性引物15-20pmol3)DEPC-。。1)TotalRNA/mRNA50ng-5μg/5-500ng2)AnchoredOligo(dT)18(µg/µl)1µl3)orRandomPrimer(N9)()SP2pmol5)2×ESReactionMix10μl6)EasyScriptRT/RIEnzymeMix1μ7)RNase-freeWaterto20µ4、轻轻混匀如用AnchoredOligo(dT)18或基因特异引物(GSP),42°C孵育30min。如用Randomprimer,25°C孵育10min,42°C孵育30min。5、85°C加热5min失活EasyScriptRT。三)胶回收在含合适抗生素的培养基中接种目标菌株,于37℃摇床充分振荡培养12-16h。菌液状态对质粒得率非常关键,请用不超过容器容量1/4体积的培养基进行培养。处于生长平台期的菌体用于质粒抽提得率最高,过度培养可能导致DNA降解。,-5ml菌液,于室温,8,000×g离心2min收集菌体,倒尽或吸干培养基。※对于高拷贝质粒,从5ml过夜菌液中通常可以获得超过20μg质粒DNA,不推荐使用更大的菌液量。※对于低拷贝质粒,如果使用更多的菌液,则同一个样品分多管收集,每管不超过5ml,分别裂解,合并同一个样品的各管裂解液通过同一个吸附柱来获得更高的得率。,吸打或振荡至彻底悬浮菌体。BufferP1首次使用时请检查是否已加入RNaseA一定要彻底悬浮菌体,否则影响得率和质量如果使用VisualLyse,则在加入250μlP1后再加入1μlVisualLyse,振荡混匀VisualLyse需在临用前加入,
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