重组体克隆的筛选和鉴定.ppt

:接纳载体或重组分子的转化细胞。非转化子:未接纳载体或重组分子的转化细胞。重组子:含有重组DNA分子的转化子。非重组子:仅含有空载载体分子的转化子。期望重组子:含有目的基因的重组子。非期望重组子:不含有目的基因的重组子。一、抗药性标记及其插入失活选择法pBR322质粒上有两个抗菌素抗性基因:Tetr和Ampr。Tetr上有插入位点BamHI和SalI;Ampr上有插入位点PstI。:pBR322(1)四环素:(2)氨苄青霉素抗性基因:-内酰胺酶,使氨苄青霉素转变为青霉酮酸,使碘-青霉素指示液(I2-KI-Aampicillin)(蓝灰色)褪色。抑制细菌生长,但不杀死细菌。杀死生长的细菌,但不杀死停止生长的细菌。(3)环丝氨酸::如果在Tetr上插入外源DNA,导致四环素抗性基因失活,可用四环素加环丝氨酸平板培养基选择重组克隆。Tetr失活的菌生长被四环素抑制,不被环丝氨酸杀死,保留下来;Tetr不失活的菌抗四环素,能分裂生长,反而被环丝氨酸杀死。(1)四环素抗性插入失活无环丝氨酸培养基(2)氨苄青霉素抗性插入失活选择过程如果Ampr上插入外源DNA,导致氨苄青霉素抗性基因失活,可用碘-青霉素指示液选择。二、-半乳糖苷酶显色反应选择法-半乳糖苷酶乳糖半乳糖葡萄糖Xgal半乳糖5-溴-4-氯靛蓝++:载体上有一段-半乳糖苷酶基因(LacZ)的片段(氨基端),其上有外源DNA的插入位点。受体菌基因组中有突变的-半乳糖苷酶基因(片段缺失)。可以被IPTG诱导表达。载体和受体菌基因组可以互补形成完整有功能的-半乳糖苷酶。假阳性:如果插入的外源DNA正好是3的倍数并且没有中止密码;(不破坏肽)。