两种常用纤维素酶活力测定方法---滤纸酶活-CMC酶活供参习.doc

薂莈膇袈莅肇检测纤维素酶酶活力—滤纸酶活力(FPA)芁莈袃滤纸酶活力代表了纤维素酶的三种酶组分协同作用后的总酶活。肅螃莃采用3,5一二硝基水杨酸法测定酶活:(简称DNS法)肀蒈衿1、原理:纤维素经纤维素酶水解后生成还原糖,还原糖能将3,5一二硝基水杨酸中硝基还原成氨基,溶液变为橙色的氨基化合物,即:3一氨基一5二硝基水杨酸,在一定的还原糖浓度范围内,橙色的深度与还原糖的浓度成正比,据此可以推算出纤维素酶的活力。蒆薄螅2、采用的滤纸酶活单位定义:肃薈袃滤纸酶活反映了纤维素酶的3种水解酶,即内切型葡聚糖酶、外切型葡聚糖酶和β葡聚糖苷酶组成的诱导复合酶系的协同水解纤维素能力。是该菌株整个纤维素酶系的酶活力水平的综合体现。代表了纤维素酶的三种酶组分协同作用后的总酶活。在此滤纸酶活单位定义为:以滤纸为底物,在一定反应条件(,50℃,恒温lh)下,以水解反应中,1ml纤维素酶液1min催化纤维素生成lug葡萄糖为1个滤纸酶活单位,以U表示。袇羂蕿3、滤纸酶活力(FPA)的测定:,,-乙酸钠缓冲液lml或柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液lml;芇蚄薄再加入50±(1cmx6cm)一条,于50℃保温酶解反应1小时,(先预热5分钟);蚀螈羃加入DNS显色液3ml(),放入已沸腾的水中沸水浴lOmin,流水冷却后在540nm下测吸光度;蚈膂羀同时用100℃煮沸lOmin后失活的酶液做对照,扣除本底;蚃袈罿根据吸光度从葡萄糖标准曲线中查出相应的葡萄糖含量,根据生成的葡萄糖克数计算出酶活值。螅袄薇滤纸酶活按下面公式计算:蒂羇肃X=(WxNxlOOO)/(TxM)膆薆莁X:为滤纸酶酶活力,单位U/mL。芁羇蒇W:为从葡萄糖标准曲线中查得的葡萄糖的浓度。薇肄莆N:为酶液稀释总倍数。羀肇膂T:为反应时间。羈螆螂M:为样品的体积。肃膇腿4、葡萄糖标准曲线绘制方法膅膃膅标准曲线绘制:取25ml具塞刻度试管6支,、、、、、,、、、、、,,混匀后在沸水浴中加热5分钟,取出立即用冷水冷却,用水定容至25ml,摇匀,测吸光度A,以吸光度为纵坐标,葡萄糖的含量为横坐标,绘制标准曲线。螂芇节5、3,5二硝基水杨酸(DNS),5-二硝基水杨酸用水溶解,,182克酒石酸钾钠,加500ml水,,搅拌溶解,冷却,定容至1000ml,存于棕色瓶中,放置7天后使用。薀蚁蚇纤维素酶活力的测定——CMC糖化力法羆莃膈定义:1毫升液体酶(或1克固体酶粉),在40℃pH﹦,每分钟水解羧甲基纤维素钠(CMC-Na),,即为1个酶活单位,以u/g(u/ml)表示。薃蚁莂原理:莇肅芀CMC-Na在纤维素酶的作用下,水解产生纤维寡糖、纤维二糖、葡萄糖等还原糖,还原糖能将3,5﹣二硝基水杨酸中的硝基还原成橙黄色的氨基化合物,在540nm波长下测定吸光度值A,吸光度与酶活成正比。CMC-Na糖化力主要代表内切β--葡聚糖的活力。莂螁荿试剂:螈莅