牛乳铁蛋白抗菌肽（lactoferricin）基因的克隆与表达质粒构建.pdf

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安徽农业科学,.,:—
. 责任编辑姜丽责任校对况玲玲
牛乳铁蛋白抗茵肽基因的克隆与表达质粒构建
邓强,王春晓,鲁建章,朱政刘承初,刘景晶上海水产大学食品学院,上海..浙江省医学科学院保健食
品研究所,浙江杭州;.复旦大学上海医学院,上海;.中国药科大学生命科学与技术学院,江苏南京
摘要按大肠杆菌偏爱密码子设计了牛乳铁蛋白肽的段引物序列,通过合成,经双酶切后克隆入
点之间,构建出牛乳铁蛋白肽的表达载体,转化至,获得牛的乳铁蛋白肽基因克隆菌。该克隆茵经诱导后,可表达出
可观的融合蛋白,且表达量与诱导时间呈一定相关性。
关键词乳铁蛋白;牛乳铁蛋白肽;基因克隆;融合表达
中图分类号文献标识码文章编号——

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乳铁蛋白,是一种天然的铁结合蛋白, 酶,离心柱型产物纯化试剂盒购自北京天维生物技术
存在于人及大多数哺乳动物的乳汁中,也存在于唾液、泪液、有限公司;引物由上海英骏生物技术有限公司合成。
胰液以及其他的身体分勿中。乳铁蛋白涪陛多肽, . 表达牛乳铁蛋白肽的基因片段的合成依据
是在消化道内经酸性胃蛋白酶水解后的小肽。大量的氨基酸序列,
研究表明,具有广谱抗细菌、抗病毒、抗真菌活性,它选用大肠杆菌偏爱的密码子设计段寡核苷酸片段『.,
们虽然没有铁离子结合位点,但杀菌活性却比高,可:;
用于开发新型的保健食品和绿色食品添加剂。但开发;引入位
会遇到许多困难,其中,遇到的最大问题是制造成本太高, 点,:
大量制造较困难,难以实现商品化。应用基因工程技术将牛,:

乳铁蛋白肽基因转入其他生物中表达,是解决工一△
业用来源不足的最具潜力的途径,但国内关于引入Ⅲ位点。先将
基因层次的研究于年后才起因此,构建基因工引物片段和引物片段退火连接,再以得到的互
程菌生产具有重要意义。拼片段为模板,以引物片段和引物片段
为此,笔者以舢为宿主菌,质粒为表达为引物经;,,,
载体,天门冬酰胺酶切除信号肽的末端片段为融合伙伴, 个循环;扩增目的片段—。经
并突变融合伙伴中的一酸敏感位点;在融合伙伴和小量产物纯化试剂盒纯化后,用和Ⅲ
目的肽结合处引入一酸敏感位点,在目的肽端引双酶切,酶切产物再用小量产物纯化试剂盒纯化。
入额外的,形成二肽酶Ⅳ识别的端点。通. 表达载体质粒的提取、酶切与纯化采用碱抽
过对融合蛋白酸水解除去融合伙伴,二肽酶切除端多余提法小量提取质粒,之后用和双酶切。
.片段,就可以使目的肽释放出来,这为进一步获得将酶切产物在.%琼脂糖凝胶上进行电泳分离,切胶回收
大量可供试验研究和临床应用的创造条件。质粒大片段,由小量胶回收试剂盒回收。
材料与方法. 表达载体的构建连接酶连接目的
. ,
中国药科大学刘景晶教授馈赠。其中,质粒是在商品化素平板挑取转化子,送样至上海捷瑞生物工程有限公
质粒。基础上改造的,是适合于短肽高效表达与加工司,测定转化子质粒的启动子后核苷酸序列。
的重组质粒。该重组质粒是将消去唯一酸水解位点的一天.
门冬酰胺酶末端肽基因以